HS-1200對二乙基亞硝胺誘導原發性肝癌大鼠肝臟的保護作用及機制

許淼，秦成勇，劉瑛(濟南醫院,濟南5003；山東省立醫院)

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HS-1200對二乙基亞硝胺誘導原發性肝癌大鼠肝臟的保護作用及機制

許淼1，2，秦成勇2，劉瑛1
(1濟南醫院,濟南250013；2山東省立醫院)

目的 觀察鵝去氧膽酸衍生物HS-1200對二乙基亞硝胺(DEN)誘導的原發性肝癌(HCC)大鼠肝臟的保護作用并探討其機制。方法 取75只大鼠，適應性喂養2周后隨機分成五組各15只，對照組給予等量生理鹽水腹腔注射。HS-1200組給予等量生理鹽水腹腔注射6周，同時給予HS-1200按80 mg/kg灌胃，1次/d，至20周末。HCC組以腹腔注射DEN誘導大鼠建立原發性肝癌模型。HCC+HS-1200低劑量組造模同時，給予HS-1200按40 mg/kg灌胃，1次/d，至第20周。HCC+HS-1200高劑量組造模同時，給予HS-1200按80 mg/kg灌胃，1次/d,至第20周。大鼠心臟采血，用ELISA法檢測血清中ALT、AST、甲胎蛋白(AFP)水平。采血后處死大鼠，稱體質量，取其肝臟稱重，計算肝重/體質量(肝臟系數)，并進行病理學檢查。取各組大鼠的肝組織，分別提取RNA，應用實時熒光定量RT-PCR法檢測各組大鼠肝組織中MTH1 mRNA表達。結果 與對照組相比，HCC組血清ALT、AST和AFP水平升高(P<0.05)。與HCC組相比，HCC+HS-1200低劑量組、HCC+HS-1200高劑量組血清ALT、AST和AFP水平降低(P<0.05)且HCC+HS-1200高劑量組更明顯。與HCC組相比,HCC+HS-1200低劑量組、HCC+HS-1200高劑量組大鼠體質量增加,肝臟重量和肝重/體質量降低(P均<0.05)。肝癌大鼠接受低或高劑量的HS-1200治療后,癌癥細胞巢形成和細胞壞死減少,HS-1200高劑量組更明顯。對照組、HS-1200組、HCC組、HCC+HS-1200低劑量組、HCC+HS-1200高劑量組MTH1 mRNA表達量分別為1、1.12±0.11、16.23±0.74、9.48±0.46、6.13±0.33，五組間兩兩比較，P均<0.05。結論 HS-1200可能通過下調升高的MTH1水平來抑制模型大鼠肝癌發生并改善其肝功能，且HS-1200對肝臟的保護作用與其劑量有關，80 mg/kg HS-1200作用效果更好。

原發性肝癌;二乙基亞硝胺;鵝去氧膽酸衍生物HS-1200;MutT同源蛋白1基因；大鼠

HS-1200是鵝去氧膽酸的衍生物,具有廣泛的抗癌活性。HS-1200可抑制前列腺癌細胞[1]、結腸癌細胞[2]和乳腺癌細胞[3]等的增殖,促進細胞凋亡。HS-1200在人肝癌細胞株BEL7402、HepG2細胞中可發揮促凋亡作用。但HS-1200對生物體內肝癌是否有潛在的抗癌作用目前尚未闡明。二乙基亞硝胺(DEN)對肝細胞DNA有損傷作用，可破壞肝細胞的抗氧化防御途徑，導致肝癌[4]。2015年11月～2017年2月，我們通過注射化學致癌物DEN誘導大鼠肝癌模型,探討HS-1200對DEN誘導原發性肝癌大鼠肝臟的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性Wistar大鼠75只,8周齡，體質量(180±10)g，購自山東大學動物實驗中心。均給予自由攝食、飲水。DEN(0.95 g/mL,純度>99.9%)購自美國Sigma公司。HS-1200是與山東師范大學化學院合作共同合成,用核磁共振頻譜儀測得該衍生物的氫譜圖為：1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ7.34 (br s, 5H), 6.00 (br s, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.11 (q, 2H, J=7.33), 3.55～3.47 (m, 2H), 2.57 (t, 2H, J =6.59), 2.29～0.89 (m, 34H), 0.63 (s, 3H)。

1.2 分組、造模及干預 取75只大鼠適應性喂養2周后隨機分成五組各15只，對照組僅給予等量生理鹽水腹腔注射。HS-1200組給予等量生理鹽水腹腔注射6周，同時HS-1200按80 mg/kg灌胃，1次/d，至20周。HCC組、HCC+HS-1200低劑量組、HCC+HS-1200高劑量組建立肝癌模型：前期實驗我們曾用DEN成功誘導20只大鼠建立了肝癌模型，本實驗參照之前的方法，于第3周開始大鼠腹腔注射DEN溶液(濃度2 g/L)，每次20 mg/kg，1次/周，共2周；于第5周開始增加DEN劑量為40 mg/kg，1次/周，共2周；第7周開始增加DEN劑量為60 mg/kg，1次/周，共2周。停用DEN，在正常飲食下繼續飼養至第20周。HCC+HS-1200低劑量組，造模同時給予HS-1200 40 mg/kg灌胃，1次/d，至第20周。HCC+HS-1200高劑量組，造模同時給予HS-1200 80 mg/kg灌胃，1次/d,至第20周。

1.3 各組大鼠血清AFP、ALT、AST檢測 20周后大鼠心臟采血，應用ELISA法檢測各組大鼠血清中AFP、ALT、AST水平。

1.4 各組大鼠肝重、體質量、肝臟系數測算及病理變化觀察 取血后處死大鼠，稱大鼠體質量，取其肝臟稱重，計算肝臟系數(肝重/體質量)及肝結節計數，并進行HE染色，病理學檢查。

1.5 肝組織中MTH1 mRNA表達檢測 取各組大鼠的肝組織，分別提取RNA，使用PrimeScripTMRT reagent Kit With gDNA Erase(寶生物工程大連有限公司)按照寶生物反轉錄說明書所示操作，應用LightCycler Real Time PCR擴增儀進行擴增，實時熒光定量RT-PCR法檢測各組大鼠肝組織中MTH1 mRNA表達。預變性95 ℃ 10 s。PCR反應:95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環。融解曲線分析：95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s。反應結束后確認Real time PCR的擴增曲線和融解曲線。以對照組大鼠肝臟MTH1 mRNA的平均表達水平1為標準對照，計算其余各組MTH1與β-actin比值。

2 結果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST和AFP水平比較 詳見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST和AFP水平比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與HCC組相比，#P<0.05；與HCC+HS-1200低劑量組相比，△P<0.05。

2.2 各組大鼠肝重、體質量、肝臟系數及病理改變 各組大鼠肝重、體質量、肝臟系數比較見表2。肝臟病理學觀察顯示對照組和HS-1200組肝小葉結構正常,無變性和壞死現象;HCC組肝細胞索排列紊亂,肝小葉組織正常結構消失,炎癥細胞浸潤現象嚴重,可見癌巢,腫瘤細胞異型性明顯,間質血竇豐富,可見大片狀壞死;HCC+HS-1200低劑量組肝細胞排列紊亂，肝小葉正常結構亦消失，可見假小葉，偶見癌巢及出血壞死，HCC+HS-1200高劑量組肝小葉正常結構消失，偶見假小葉，炎癥細胞浸潤不明顯，無明顯癌巢。

表2 各組大鼠肝重、體質量及肝臟系數比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與HCC組相比，#P<0.05；與HCC+HS-1200低劑量組相比，△P<0.05。

2.3 各組大鼠肝組織中MTH1 mRNA表達比較 對照組、HS-1200組、HCC組、HCC+HS-1200低劑量組、HCC+HS-1200高劑量組MTH1mRNA表達量分別為1、1.12±0.11、16.23±0.74、9.48±0.46、6.13±0.33，五組比較及五組間兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

親水性膽汁酸藥物HS-1200為新型鵝脫氧膽酸衍生物，在近年基礎研究和臨床實踐中有研究報道了HS-1200的體外抗癌效應，但有關動物體內研究的報道較少。

前期實驗中，我們成功建立了腹腔注射DEN誘導大鼠原發性肝癌模型，經口服灌胃HS-1200后，暴露于DEN的大鼠肝癌發生和肝組織病理變化顯著減少，同時肝功能明顯改善。而且，HS-1200對肝癌的抑制作用與其劑量呈正相關。給予大鼠HS-1200口服灌胃100 mg/(kg·d)，對大鼠肝臟或腎臟功能無明顯毒性作用。而且，我們首次發現了HS-1200低劑量[40 mg/(kg·d)]和高劑量[80 mg/(kg·d)]口服灌胃，可抑制暴露于DEN的大鼠發生肝癌，證明HS-1200在原發性肝癌大鼠模型中發揮抑制肝癌發生的作用。此外，我們的研究顯示HS-1200可阻止暴露于DEN的大鼠肝臟病理變化，并逆轉其升高的血清ALT、AST和AFP水平。

MTH1是MutT 的同源酶，是MTH1基因編碼的一種具有三磷酸酶活性的糖基化酶，主要參與DNA 損傷修復過程，而正常細胞不需要MTH1。氧化應激DNA損傷在肝癌發生發展過程中起重要作用，而MTH1在DNA氧化損傷的修復中扮演重要角色。氧化應激由于過度生成活性氧(ROS)等自由基被認為引起遺傳不穩定性，從而引發致癌作用[5]。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是一種廣泛接受的ROS觸發氧化DNA損傷的DNA損傷標記物[6]。MTH1可在游離核苷酸池中水解8-OH-dGTP為8-OH-dGMP, 從而防止8-OHdG錯配入DNA，減少或避免DNA突變的發生。研究已證明,癌細胞阻止8-OHdG氧化的dNTPs錯配入DNA需要DNA修復基因MTH1的激活，從而防止ROS誘導的DNA損傷。MTH1表達增加可消除氧化應激產生的多余8-OHdG。現已證明包括肝癌在內的數種類型的癌癥細胞中存在MTH1上調。Obtulowicz等[7]研究表明,惡性大腸癌的產生會導致腫瘤氧化應激，從而促進MTH1表達上調。Borrego等[8]研究發現，MTH1表達水平與胃癌細胞的惡性程度呈正相關，證明MTH1 可作為檢測胃癌發展的標志物。Kennedy 等[9]研究顯示，肺癌細胞亟需MTH1清除損傷的DNA 結構以維持癌細胞的正常分裂，且根據MTH1 表達水平差異可預測肺腫瘤細胞的氧化應激水平。Jungst等[10]發現MTH1在肝腫瘤中表達明顯高于相應的非腫瘤組織。MTH1在正常細胞中是非必需蛋白酶，維持細胞的正常生長不依賴于MTH1的蛋白功能。因此，MTH1有可能只與異常的細胞生長密切相關，這一特性使得MTH1 作為特異性的治療靶點用于干預和治療腫瘤成為可能。Nakabeppu 等[11]報道MTH1抑制劑會增加氧化損傷,提高細胞毒性,誘導癌細胞凋亡，MTH1抑制劑可能是一個更好的靶向癌癥治療策略。本研究發現，HS-1200抑制了MTH1的上調，HS-1200有可能作為一種MTH1抑制劑用于肝癌的治療。與目前的文獻證據相一致，我們檢測到暴露于DEN的大鼠肝組織中MTH1 mRNA表達增加，HS-1200的應用似乎扭轉了MTH1 mRNA的上調，并呈劑量依賴性。我們的研究結果表明,HS-1200通過促進肝臟組織中DNA修復和誘導已升高的MTH1下調，來防止腫瘤發生和預防肝損傷。事實上,目前小分子MTH1抑制劑已被認為是有前途的靶向抗癌治療策略，我們推測HS-1200可作為MTH1抑制劑用于肝癌的治療。正常細胞不依賴于MTH1 的功能維持生存，因此靶向MTH1 治療腫瘤并不影響正常細胞的功能[12]。我們對HS-1200進行了安全性評估實驗，發現此藥對于大鼠肝臟或腎臟功能無明顯影響，所以作為MTH1抑制劑是安全的，這為臨床預防高危人群的肝癌發生提供了可行性新思路。

綜上所述，HS-1200可能通過下調升高的MTH1水平來抑制模型大鼠肝癌的發生并改善其肝功能，且HS-1200對肝臟的保護作用與其劑量有關，80 mg/kg HS-1200作用效果更好。

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秦成勇(E-mail:chengyongqin2000@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.010

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