缺血后預處理對缺血再灌注大鼠肝內膽管細胞損傷的影響及機制

郭懷斌,劉小帥,張萬星,王蘭輝,溫軍業,脫紅芳(河北省人民醫院,石家莊050051)

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缺血后預處理對缺血再灌注大鼠肝內膽管細胞損傷的影響及機制

郭懷斌,劉小帥,張萬星,王蘭輝,溫軍業,脫紅芳
(河北省人民醫院,石家莊050051)

目的 觀察缺血后預處理對缺血再灌注大鼠肝內膽管細胞損傷的影響并探討其機制。方法 取健康雄性SD大鼠24只，隨機分為假手術組、缺血再灌注組、缺血后處理組，每組8只。假手術組：大鼠麻醉后于上腹部正中取一長3.5 cm縱切口，將腹壁各層依次切開，肝臟顯露后進一步游離出肝十二指腸韌帶，關腹，無其他干預。缺血再灌注組：在假手術組基礎上，游離肝十二指腸韌帶，用無損傷動脈夾將肝門區域夾閉，缺血30 min后取下血管夾，使血管開放，對肝臟持續再灌注，最后關腹。缺血后處理組：在缺血再灌注組基礎上，血供完全恢復之前再灌注10 s，夾閉10 s，如此反復6個循環(共2 min)后完全恢復血供。比色法測定血清γ-GT、SOD活力，免疫組化法測定膽管組織中Bcl-2和Bax蛋白表達，采用原位缺口末端標記法測算膽管細胞凋亡指數(AI)，HE染色后光鏡下觀察膽管上皮細胞基本形態學變化。結果 IR組、IPO組、SO組血清γ-GT值分別為(34.64±3.28)、(26.30±3.32)、(17.33±2.08)U/L，三組間兩兩比較，P均<0.05。SO組、IR組、IPO組大鼠血清SOD活力值分別為(58.26±3.00)、(60.28±3.73)、(61.53±7.99)U/mL，各組間比較，P均>0.05。IR組、IPO組、SO組膽管組織中Bcl-2蛋白陽性表達率分別為(42.67±3.73)%、(77.94±5.25)%、(18.21±4.16)%，三組間兩兩比較，P均<0.05。IR組、IPO組、SO組膽管組織中Bax蛋白陽性表達率分別為(90.17±2.12)%、(70.10±4.27)%、(30.63±3.00)%，三組間兩兩比較，P均<0.05。IR組、SO組、IPO組AI分別為79.31±1.12、26.06±2.27、58.90±2.75，三組間兩兩比較，P均<0.05。IPO組病理改變較IR組明顯減輕，肝小葉結構較完整，肝細胞變性程度減輕，匯管區膽管上皮連續完整，炎細胞浸潤少。結論 缺血后預處理通過促進肝內膽管組織中Bcl-2蛋白表達、抑制Bax蛋白表達，抑制SD大鼠肝臟缺血再灌注過程中肝內膽管細胞凋亡，從而減輕肝臟缺血再灌注過程中肝內膽管細胞的損傷。

肝內膽管；再灌注損傷；缺血后處理；細胞凋亡；B細胞淋巴瘤/白血病基因-2；B細胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白x；大鼠

調節B細胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)/B細胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白x(Bax)表達對細胞凋亡有抑制作用[1]，誘導肝臟缺血再灌注(IR)損傷過程中肝細胞凋亡能減輕肝細胞的損傷[2]。我們前期研究表明，缺血后處理可有效減輕肝臟缺血再灌注損傷及再灌注過程中肝細胞損傷，肝細胞Bcl-2蛋白表達升高，抑制肝細胞凋亡，能減輕肝臟缺血再灌注損傷過程中肝細胞損傷[3]。本研究探討缺血后處理能否通過調節Bcl-2/Bax蛋白表達，減輕再灌注過程中肝內膽管細胞的凋亡,從而減輕再灌注過程中肝內膽管細胞的損傷。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠24只，體質量200～300 g，由河北醫科大學動物實驗中心提供。小動物手術器械購自上海手術器械廠，冰箱BD120購自青島海爾股份有限公司，醫用微波爐 YWY781B型購自浙江臨安愛迪儀器廠，低溫冰箱 MDF-382E型購自日本三洋，可見分光光度計722購自上海分析儀器廠，光鏡顯微照相機購自日本尼康，多功能圖象分析管理系統購自美國Media Cybernetics公司，高速離心機購自上海醫用分析儀器廠，干燥箱 MIR-153型購自日本三洋，顯微鏡BX51T-PHD-J11購自日本奧林巴斯。戊巴比妥鈉購自上海生物化學試劑公司，多聚甲醛購自河北省老年病臨研中心，冰醋酸購自河北省人民醫院臨研中心，γ-谷氨酰胺轉肽酶(GGT)測試盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒購自南京建成生物工程研究所，Bcl-2抗體、Bax 抗體購自河北博海生物工程開發有限公司，原位細胞凋亡檢測試劑盒購自美國ROCHE公司，SP-9002免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋。

1.2 動物分組及造模 將24只SD大鼠隨機分為3組，每組8只，分別是假手術(SO)組、缺血再灌注(IR)組和缺血后預處理(IPO)組。實驗動物術前12 h禁食，自由進水，0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔內注射麻醉，手術操作在無菌條件下進行。SO組：大鼠麻醉后，常規備皮、消毒、鋪無菌巾，于上腹部正中取一長3.5 cm縱切口，將腹壁各層依次切開，肝臟顯露后進一步游離出肝十二指腸韌帶，關腹，無其他干預。IR組：在SO組基礎上，游離肝十二指腸韌帶，模擬Pringle法，用無損傷動脈夾將肝門區域夾閉，造成肝臟缺血，缺血30 min后取下血管夾，使血管開放，對肝臟持續再灌注，最后關腹。IPO組：在IR組基礎上，血供完全恢復之前再灌注10 s，夾閉10 s，如此反復6個循環(共2 min)后再完全恢復血供。

1.3 血清γ-GT和超氧化物歧化酶(SOD)活力測定 由心臟取全血，常溫靜置30 min，放入離心機3 000 r/min，離心15 min，提取血清標本。比色法測定血清γ-GT活力：γ-GT催化底物反應，游離出對硝基苯胺，與受體作用。酶促反應產物對硝基苯胺在410 nm處有強吸收峰，可直接比色測定吸光度值，從而計算出γ-GT活力。血清中γ-GT活力(U/L)=(測定吸光度值-對照吸光度值)×232.56。比色法測定SOD活力：通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基(O2-)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，用可見光分光光度計測其吸光度。當被測樣品中含SOD時，則對(O2-)有專一性的抑制作用，使其形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。定義：每毫升反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD 活力單位(U)。計算公式:血清中總SOD活力(U/mL)=(對照OD值-測定OD值)/對照OD值÷50%×反應體系的稀釋倍數×樣本測試前的稀釋倍數。

1.4 Bcl-2和Bax蛋白表達測定 實驗動物于關腹4 h后再次開腹取材，迅速于肝門部位取肝組織標本，置于10%中性甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋。免疫組化法測定膽管組織中Bcl-2和Bax蛋白表達，按照免疫組化試劑盒說明書常規SP法檢測膽管組織切片Bcl-2和Bax蛋白表達率，以膽管上皮細胞核膜、胞質出現棕黃色顆粒為蛋白表達陽性，在400倍光鏡下隨機選取5個膽管組織，計算公式：陽性率=陽性細胞數/視野內細胞總數×100%。

1.5 膽管細胞凋亡指數(AI)測算 采用原位缺口末端標記法(TUNEL)。按細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，檢測膽管上皮細胞凋亡。正常細胞核為藍色，凋亡細胞核為棕黃色、核固縮、染色質邊聚、凝集成塊，并可見散在棕色的凋亡小體。計算AI，每例標本的切片在高倍光學顯微鏡(×400)視野下選取5個膽管組織，計算凋亡細胞占總細胞的百分比，即AI。AI%=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.6 膽管形態學觀察 組織石蠟包埋塊行5 μm厚連續切片，HE染色后光鏡下觀察膽管立方上皮細胞基本形態。

2 結果

2.1 各組血清γ-GT、SOD活力值比較 IR組、IPO組、SO組血清γ-GT值分別為(34.64±3.28)、(26.30±3.32)、(17.33±2.08)U/L，三組間兩兩比較差異有統計學意義(P均<0.05)。SO組、IR組、IPO組大鼠血清SOD活力值分別為(58.26±3.00)、(60.28±3.73)、(61.53±7.99)U/mL，各組間比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

2.2 各組Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達比較 IR組、IPO組、SO組膽管組織中Bcl-2蛋白陽性表達率分別為(42.67±3.73)%、(77.94±5.25)%、(18.21±4.16)%，三組間兩兩比較，P均<0.05。IR組、IPO組、SO組膽管組織中Bax蛋白陽性表達率分別為(90.17±2.12)%、(70.10±4.27)%、(30.63±3.00)%，三組間兩兩比較，差異有統計學意義(P均<0.05)。

2.3 各組膽管細胞AI比較 SO組膽管組織中僅可見有少量凋亡細胞表達，IR組膽管組織中凋亡細胞數量增多，IR組、SO組、IPO組AI分別為79.31±1.12、26.06±2.27、58.90±2.75，三組間兩兩比較，差異有統計學意義(P均<0.05)。

2.4 各組膽管形態學變化 SO組肝組織中肝細胞條理整齊，肝小葉結構未見損壞，匯管區正常，膽管結構無異常，偶可見少量中性粒細胞浸潤。IR組則可見部分肝小葉無清晰的結構顯現，在中央靜脈周圍可見大片壞死的肝細胞，匯管區肝內膽管可見上皮細胞損傷，并伴有大量炎性細胞浸潤，細胞凋亡較多。IPO組病理改變較IR組明顯減輕，肝小葉結構較完整，肝細胞變性程度減輕，匯管區膽管上皮連續完整，炎細胞浸潤少。

3 討論

與肝細胞不同，膽管是完全由肝動脈單一血供，并且膽管細胞是一高氧耗、高代謝、低缺氧耐受的“嬌貴”的細胞群體，在外科術中相對于肝細胞更易受到損傷[4]。近年來，肝臟IR過程中的膽管損傷在肝臟IR的重要性逐漸被認識。IR發生后，在造成肝細胞損傷的同時，亦造成膽管細胞損傷，導致膽道發生病變[5]。在肝臟IR過程中肝內膽管組織的損傷機制中，膽管細胞凋亡所引起膽道結構及功能的紊亂是術后各種膽源性并發癥發生的重要因素之一，影響患者預后。

缺血預處理被證明在肝臟IR中可抑制膽管上皮細胞凋亡，但由于組織器官損傷一旦形成,缺血預處理則失去了治療的最佳時間。Zhao等[6]于2003年提出IPO，在缺血結束后、再灌注前，給予多次短暫停灌、復灌處理，有與缺血預處理相似的保護作用，彌補了缺血預處理的不足，而且其操作簡單、時間從容、具有可控性。研究發現[7]，當再灌注開始1 min后，再進行IPO，則其保護作用基本消失，提示IPO對缺血再灌注發揮保護作用主要的時間窗是在再灌注開始后第1分鐘內。因此本實驗采用了再灌注開始后開放10 s、夾閉10 s，循環6次的方式，目的是使IPO能在有效時間窗內發揮作用。本研究肝臟組織HE染色結果顯示，IPO組肝臟組織損傷較IR組明顯減輕，肝小葉結構較完整，與我們前期的研究結果一致，表明IPO可有效減輕肝臟IR損傷以及IR過程中肝細胞損傷[3]，同時本研究發現IPO組匯管區炎性浸潤較IR組減輕，膽管上皮細胞損傷亦減輕，并且膽管損傷的標志性酶[8]γ-GT水平亦較IR組降低，提示IPO能減輕肝臟IR過程中膽管細胞的損傷。

本研究通過觀察膽管細胞AI，發現IPO組AI較IR組下降。有學者在研究氧自由基清除劑依達拉奉對大鼠再灌注過程中膽管上皮細胞的保護作用時發現，當膽管細胞凋亡增加時，膽管的損傷加重[9]。本研究發現IPO組膽管損傷較IR組減輕，膽管細胞的凋亡較IR組減少，AI較IR組顯著下降，IPO對膽管細胞的保護作用可能與抑制膽管上皮細胞的凋亡有關。細胞凋亡的發生和Bcl-2/Bax這組主要的促凋亡蛋白/抑凋亡蛋白組合的相對濃度有密切關系[1～3，10]。本研究通過免疫組化染色觀察膽管組織中Bcl-2和Bax蛋白表達，發現IPO組較IR組膽管組織中抑制細胞凋亡的Bcl-2蛋白高表達，促進細胞凋亡的Bax蛋白低表達，與IPO組較IR組膽管細胞AI下降的結果相一致。本研究結果顯示，經過IPO的大鼠膽管組織內抑制細胞凋亡的Bcl-2蛋白升高，促進細胞凋亡的Bax蛋白降低，膽管細胞AI減低，匯管區炎性浸潤較IR組減輕，膽管上皮細胞損傷和血清γ-GT值均較IR組降低，所以IPO可通過激活膽管組織中Bcl-2蛋白表達、抑制Bax蛋白表達，抑制肝臟IR過程膽管上皮細胞的凋亡，減輕膽管的損傷，從而對肝臟IR過程膽管損傷產生保護作用。本組外周血中SOD活性各組比較差異無統計學意義，我們前期的研究發現，IPO大鼠肝臟組織勻漿中SOD活性明顯較IR的升高[2]，外周血中SOD活性各組無統計學差異，提示外周血SOD活性易受其他因素干擾，而肝組織勻漿中SOD活性測定能更好地反映肝臟IR損傷。

綜上所述，IPO通過促進Bcl-2蛋白表達、抑制Bax蛋白表達，抑制SD大鼠肝臟IR過程中肝內膽管細胞凋亡，從而減輕肝臟IR過程中肝內膽管細胞的損傷。

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張萬星(E-mail:zhangwx12@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.011

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1002-266X(2017)25-0037-03

2017-03-02)