基于損傷面積控制大鼠胰腺創(chuàng)傷模型的建立及意義

王海林，肖和達，鄧超，劉衛(wèi)輝，湯禮軍，戴睿武(1西南醫(yī)科大學，四川瀘州 646000;成都軍區(qū)總醫(yī)院全軍普外中心)

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基于損傷面積控制大鼠胰腺創(chuàng)傷模型的建立及意義

王海林1,2，肖和達2，鄧超2，劉衛(wèi)輝2，湯禮軍2，戴睿武1,2
(1西南醫(yī)科大學，四川瀘州 646000;2成都軍區(qū)總醫(yī)院全軍普外中心)

目的 探討建立一種新型大鼠單純胰腺創(chuàng)傷模型，并基于損傷面積評估其傷情變化。方法 將大鼠隨機分為2組，采用自主研發(fā)多功能撞擊儀的3 cm2(3 cm2致傷面積組)和6 cm2(6 cm2致傷面積組)撞擊頭，分別擠壓各組處于開腹狀態(tài)的胰腺，使之在400 kPa的壓強下形成不同面積的損傷，并設置對照組；建模24 h后觀察各組大鼠存活率、一般情況、大體病理和組織病理學改變，并檢測血鉀、血鈣的濃度和血清、腹水中淀粉酶及脂肪酶的活性。結果 與對照組比較，3 cm2和6 cm2致傷面積組均能形成明顯的損傷(P<0.05)，其中，與3 cm2致傷面積組比較，6 cm2致傷面積組損傷更顯著(P<0.05)。與3 cm2致傷面積組相比,6 cm2致傷面積組大鼠存活率、血鉀及血鈣水平更低(P均<0.05)，一般情況更差，損傷性病理改變的范圍及程度更大，血清淀粉酶、脂肪酶更高(P均<0.05)。結論 成功建立了一種基于損傷面積控制的大鼠胰腺創(chuàng)傷模型。該模型簡單、有效、可控性及可重復性好,適合用于傷情演化機制和創(chuàng)傷施救等方面的研究。

胰腺創(chuàng)傷模型；損傷面積；傷情評估；大鼠

胰腺創(chuàng)傷的發(fā)病率占腹部外傷的1%～3%[1]，隨著近年來交通事故、工業(yè)事故的頻發(fā)，胰腺創(chuàng)傷的發(fā)生呈逐年上升趨勢。胰腺創(chuàng)傷因其多發(fā)性、嚴重性、隱匿性、病死率高等特點，而成為創(chuàng)傷外科領域亟待研究的焦點[2]。而目前關于胰腺創(chuàng)傷的研究主要集中于診斷治療方面[3，4]，對于創(chuàng)傷后生理病理等變化的基礎性研究欠缺。我們擬建立一種新型穩(wěn)定的單純大鼠胰腺創(chuàng)傷模型，為研究胰腺創(chuàng)傷后的各方面生理機能變化提供合適的模型條件。

1 材料與方法

1.1 材料 健康封閉群SD大鼠50只，成年雄性，無特定病原體(SPF)級，體質(zhì)量(250±10)g，購于成都達碩實驗動物有限公司；多功能動物撞擊儀(自行研發(fā)，已獲授權專利，主要由儲能換能裝置、簡便多功能撞擊裝置和撞擊參數(shù)測量裝置等部件組成，可準確控制撞擊的接觸面積和撞擊力的大小)；動物手術器械包、水合氯醛購于四川生工科技有限公司；萬分之一天平由成都軍區(qū)總醫(yī)院中心實驗室提供；HE染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；血鉀、血鈣、淀粉酶、脂肪酶測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組與建模方法 參照我們前期的實驗研究，在400 kPa的致傷壓強下能建立穩(wěn)定的大鼠胰腺創(chuàng)傷模型[5～7]。取SD大鼠50只，隨機分為3組，A、B組每組20只，C組10只。A組接受3 cm2/12 kg的擠壓參數(shù)(即400 kPa壓強)，B組接受6 cm2/24 kg的擠壓參數(shù)(壓強同A組)，C組為假手術組。各組術前常規(guī)禁食水12 h，采用4%水合氯醛按1 mL/100 g經(jīng)腹腔注射麻醉，麻醉滿意后固定，剃毛，消毒，取上腹部正中線處開腹，以脾門和門靜脈處為界限，分離胰腺與腹腔周圍組織；A、B組將胰腺置于墊板和撞擊頭之間，調(diào)整預設定的擠壓應力參數(shù)值，用已消毒的不同擠壓面積的撞擊頭垂直擠壓胰腺，擠壓時間均為0.5 s。C組僅用棉簽輕輕按壓翻動胰腺數(shù)次，時間同A、B組。建模后各組大鼠均經(jīng)皮下注射生理鹽水補液10 mL,造模后恢復供食水，置于陰涼通風干燥適溫條件，連續(xù)觀察24 h，隨后經(jīng)腹主動脈采血處死，留取各標本待檢相關指標。

1.3 觀察指標 ①存活率和一般情況：建模后，連續(xù)觀察24 h，記錄各組存活只數(shù)和精神、活動、飲食等一般情況的變化。②大體病理改變：建模后24 h開腹觀察大體病理改變，觀察腹水性質(zhì)并抽取計量，留置腹水于-80 ℃保存供生化檢測；以門靜脈和脾門為界，分離并取出完整胰腺，置于萬分之一天平稱量胰腺濕重。③組織病理學變化：取上述胰腺組織適量，用4%多聚甲醛固定24 h,常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片(厚度6 μm)，HE染色，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察組織病理學變化；委托不知實驗分組情況的同一病理醫(yī)師，按照Dai等[1]的標準進行病理程度評分，每張切片取10個高倍視野，單張切片最終的評分為10個視野評分的均值。④生化指標：經(jīng)腹主動脈采血，離心后留置血清，存于-80 ℃冰箱，采用分光光度法，參照試劑盒說明書，檢測血鉀(K+)、鈣(Ca2+)的濃度及血清和腹水中淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)活性。

2 結果

2.1 各組存活率和一般情況變化比較 A組全部成功建模，連續(xù)觀察至24 h,死亡6只，存活14只大鼠精神萎靡，呈半被動體位，頭部僅能間斷上抬，對外界刺激(觸摸)反應一般，動態(tài)觀察少量進食；B組其中1只因造模時腸系膜血管損傷出血死亡，余下19只成功建模，24 h后死亡8只，存活11只大鼠精神及活動與A組相似，呈被動體位，略能抬頭，對觸摸反應差，連續(xù)觀察幾乎無進食；C組1只因麻醉致死，余9只24 h后全部存活。建模后10～12 h觀察可見精神漸恢復、活動自如，開始自主食水。

2.2 各組大體病理改變及腹水量、胰腺濕重比較 A、B組大鼠胰腺擠壓后，胰腺迅速充血、腫脹，少量滲出，局部現(xiàn)散在出血點，胰腺組織挫裂，B組較A組損傷面積范圍更大；C組胰腺呈淡紅色，與周圍組織界限分明，未見明顯異常。建模24 h后，開腹可見：A、B兩組胃明顯擴張伴潴留，胰腺較撞擊時腫脹更加明顯，呈粉紅色，局部散在出血壞死灶，有肉眼可見的淡紅色血性腹水形成，腸系膜及腸壁擴張充血、腫脹、滲出明顯，腸系膜根部等處的脂肪組織有壞死液化及皂化斑；C組與前述比較無明顯變化。傷后24 h A、B、C組腹水量分別為(4.57±0.51)、(7.13±0.42)、0 mL，胰腺濕重分別為(1.35±0.10)、(1.53±0.15)、(0.65±0.05)g。A、B組腹水量及胰腺濕重與C組比較，P均<0.05；A、B組腹水量及胰腺濕重比較，P均 <0.05。

2.3 各組組織病理學變化及生化指標比較 建模后24 h,光鏡所見：①胰腺實質(zhì)細胞和間質(zhì)出現(xiàn)不同程度充血水腫、壞死(核固縮、核碎裂、核溶解)等；②有輕度炎細胞浸潤，A、B組間差異無統(tǒng)計學意義；③組織內(nèi)見大量紅細胞滲出；④腺體形態(tài)改變，部分呈空泡狀，大小不一，對照組鏡下胰腺組織未見明顯病變。傷后24 h各組病理評分及生化指標(血K+、Ca2+濃度，血清、腹水中AMS及LPS活性)比較見表1。

表1 傷后24 h各組病理評分及生化指標比較

注：與C組比較，▲P<0.05；與A組比較，★P<0.05。

3 討論

胰腺位于脊柱前方，外力作用于上腹部時，由于脊柱擠壓作用，常加重胰腺損傷。胰腺創(chuàng)傷后漏診和誤診率高，且傷后發(fā)生胰漏、出血等并發(fā)癥的幾率較大[8]。

建立成功的創(chuàng)傷模型有兩大主要標準：一是保證創(chuàng)傷后實驗動物在研究時間范圍內(nèi)存活；二是目標傷情的形成[9]。我們在前期研究基礎上，已驗證了400 kPa，1 cm2的撞擊參數(shù)能使大鼠胰腺明顯創(chuàng)傷且存活率較高[5～7]。然而由于建立動物模型的最終目的是盡可能模擬與臨床創(chuàng)傷相似的病變過程[10]，故上述動物模型存在不能代表胰腺大面積創(chuàng)傷的不足之處。針對這一點，我們設計了本實驗中3、6 cm2的胰腺大面積擠壓傷模型，同時由于以擠壓為主的致傷模式產(chǎn)生的沖擊小，與快速撞擊建模方式相比，在致傷機制上主要表現(xiàn)為血管損傷較小而胰腺組織損傷更重，大鼠不易因大出血致死，從而使該模型具有致傷因素純化、損傷范圍可控、穩(wěn)定性好等特點。

本研究結果顯示，A、B組致傷后24 h，大鼠的存活率及一般情況差于C組，B組較A組的死亡率有所增加。腹水計量和胰腺濕重在A、B組間有統(tǒng)計學差異，可見隨著撞擊面積的增大，胰腺組織出血、壞死加重。組織病理評分B組高于A組。形態(tài)學方面的諸多改變表明胰腺創(chuàng)傷建模面積越大，損傷越顯著。血鉀、血鈣濃度等生化指標組間比較均有統(tǒng)計學差異，且隨創(chuàng)傷面積增加，血鉀、血鈣濃度均逐漸降低。可能原因：胰腺創(chuàng)傷后腹水的產(chǎn)生，丟失了較多的K+、Ca2+，導致血鉀、血鈣均減少；此外，胰腺細胞損傷后釋放大量胰酶，胰酶作用并分解胰周脂肪組織，后者隨后與Ca2+結合成皂化斑，這與前述大體病理變化結果吻合，此為血鈣減低的又一可能原因。

胰腺創(chuàng)傷后功能學上的變化可借助胰酶活性檢測。外力擠壓胰腺致腺泡細胞損傷，細胞內(nèi)的消化酶原被激活和釋放，造成胰腺的進行性損傷，因此，測定胰酶活性有助于預示胰腺損傷后的病情演化情況[11]。本實驗結果表明，在創(chuàng)傷后24 h，A、B組血清、腹水中的AMS均顯著高于C組，差異有統(tǒng)計學意義，而A、B組間差異無統(tǒng)計學意義；A、B組血清LPS與C組比較差異有統(tǒng)計學意義，A、B組血清LPS比較差異有統(tǒng)計學意義，而A、B組腹水LPS比較差異無統(tǒng)計學意義。因此我們認為，胰腺創(chuàng)傷后24 h，可根據(jù)血清AMS活性變化來判斷是否存在損傷；由于LPS在實驗組間具有特異性，可根據(jù)血清LPS活性評估損傷的嚴重程度；腹水AMS、LPS可作為輔助診斷指標。

綜上所述，本研究在400 kPa的瞬時擠壓參數(shù)下，成功建立了一種基于損傷面積控制的大鼠胰腺創(chuàng)傷模型，本模型能夠單純模擬胰腺大面積創(chuàng)傷，操作簡單、致傷因素單一、可控性及可重復性好，能為進一步傷情分析和創(chuàng)傷救治等研究提供良好的模型基礎。

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國家自然科學基金資助項目(81001695)；四川省科技廳應用基礎研究項目(2013JY0046)。

戴睿武(E-mail：rwdai@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.012

R576

A

1002-266X(2017)25-0040-03

2017-02-08)