結直腸腺癌組織中EZH2、Caspase-3蛋白的表達變化及意義

張立成，周毅(天津市第三中心醫(yī)院，天津30070；天津市人民醫(yī)院)

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·臨床研究·

結直腸腺癌組織中EZH2、Caspase-3蛋白的表達變化及意義

張立成1，周毅2
(1天津市第三中心醫(yī)院，天津300170；2天津市人民醫(yī)院)

目的 觀察果蠅zeste基因增強子同源物2(EZH2)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)蛋白在結直腸腺癌組織中的表達變化，并進一步探索其意義。方法 收集結直腸腺癌組織100例份，同時收集相應癌旁(距癌組織邊緣>10 cm)正常組織100例份作為對照。分別采用免疫組化法、Western blotting法檢測癌及癌旁組織中EZH2及Caspase-3蛋白表達。結果 結直腸腺癌組織中EZH2蛋白表達高于癌旁正常組織(P<0.05)，EZH2蛋白表達與腫瘤發(fā)生部位、分化程度、臨床TNM分期及淋巴結轉(zhuǎn)移相關(P均<0.05)，與年齡、性別無關(P均>0.05)。結直腸腺癌組織中Caspase-3蛋白表達低于癌旁正常組織(P<0.05)。Caspase-3蛋白陽性表達與結直腸癌患者性別、發(fā)病年齡、患病部位無關(P均>0.05)，與組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移有關(P均<0.05)。結直腸腺癌組織中EZH2和Caspase-3蛋白表達呈負相關(r=-0.64，P<0.05)。結論 結直腸腺癌組織中EZH2蛋白呈高表達，Caspase-3蛋白呈低表達；EZH2可能通過下調(diào)Caspase-3表達，參與結直腸腺癌的發(fā)生發(fā)展。

結直腸癌；果蠅zeste基因增強子同源物2蛋白；細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3

結直腸癌是消化道常見腫瘤之一，在我國已成為發(fā)病率居第三位的惡性腫瘤[1]。每年新增結直腸癌患者達100萬例，病死率約占相關惡性腫瘤患者的9%[2]。結直腸腺癌受多種因素影響，多個基因參與疾病的發(fā)展。研究表明，結直腸癌生存率與患者身體上、心理上困擾有關[3]。GD-1基因已證明在結直腸癌患者中具有重要的腫瘤抑制活性[4]。盡管進行了大量的研究工作，然而結直腸腺癌發(fā)生的分子機制目前仍不明確。PI3K-Akt信號通路在人類癌癥的成因中扮演重要角色，與細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡有關。果蠅zeste基因增強子同源物2 (EZH2)作為PcG基因家族的重要成員之一，亦參與PI3K-Akt信號通路，通過下調(diào)半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)表達促進腫瘤發(fā)生[5]。研究表明，EZH2在多種實體腫瘤組織中異常表達，如胰腺癌[6]等，EZH2可能與腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關。目前，關于EZH2 在結直腸腫瘤組織中表達的報道相對較少。Caspase-3作為PI3K-Akt信號通路的下游基因，在調(diào)控凋亡過程中發(fā)揮重要作用[7]。目前對于在結直腸腺癌組織中EZH2和Caspase-3間的相互作用機制尚不十分明確。2016年10月，我們通過免疫組化及Western blotting法，觀察EZH2、Caspase-3蛋白在結直腸腺癌組織的表達變化并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年9月～2016年9月天津市第三中心醫(yī)院普外科和天津市人民醫(yī)院肛腸科手術切除臨床病理資料完整的結直腸腺癌組織100例份，患者男48例、女52例，年齡41～85歲(中位年齡63.8歲)，其中<50歲54例，≥50歲46例。腫瘤位于左半結腸52例，右半結腸48例；根據(jù)WHO大腸腺癌的組織學分級標準：高中分化66例，低或未分化34例；根據(jù)結直腸癌 TNM 分期系統(tǒng)：T1期36例，T2期32例，T3期17例，T4期15例。淋巴結轉(zhuǎn)移37例，無轉(zhuǎn)移63例。同時收集相應距癌組織邊緣>10 cm的癌旁正常組織100例份作為對照。病例均為首發(fā)腫瘤，經(jīng)兩名病理醫(yī)師進行組織病理學檢查明確診斷，術前均未經(jīng)行放、化療等輔助治療。

1.2 結直腸腺癌組織中EZH2、Caspase-3蛋白表達檢測 組織離體后立即浸入液氮，-80 ℃冰箱保存。結直腸腺癌組織和癌旁組織均經(jīng)中性甲醛和石蠟包埋，制備3 μm厚切片，恒溫箱60 ℃內(nèi)烤片4 h，4 ℃冰箱留存，行免疫組化染色。H2O2-甲醇液中15 min，PBS洗2 min×3次，加封閉液孵育10 min。棄去液體加兔抗人EZH2 多克隆抗體(1∶200)，Caspase-3 單克隆抗體(1∶100)，4 ℃過夜。PBS洗2 min×3次，加抗小鼠生物素化二抗孵育10 min，PBS洗2 min×3次。加HRP標記鏈親和素孵育10 min，PBS洗2 min×3次。DAB顯色、水洗、復染、脫水、透明、封片。免疫組化結果由兩位有經(jīng)驗的病理學專家進行雙盲鑒定。每張切片于顯微鏡下選取5個視野，以細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。按照陽性細胞數(shù)的百分比和著色強度進行半定量積分判定：先于×40倍鏡下觀察表達情況，記錄著色強度，0分為細胞未著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；再于×400倍鏡下記錄陽性細胞數(shù)的百分比，每個視野計數(shù)100個瘤細胞，得出陽性細胞的百分率(陽性細胞數(shù)/總的瘤細胞數(shù))，陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。著色強度與陽性細胞數(shù)得分乘積為染色指數(shù)(SI)，SI>4為陽性表達：SI≤4為陰性表達。取結直腸腺癌組織和癌旁組織中活化3 h的細胞，按常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)并用BCA法進行蛋白定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗(β-actin 1∶1 000，兔抗鼠EZH2抗體1∶1 000，兔抗鼠Caspase-3抗體1∶1 000稀釋液，4 ℃孵育過夜。洗膜，加入二抗HRP 標記羊抗兔 IgG稀釋液(1∶2 000)，室溫下孵育2 h，用免疫熒光成像系統(tǒng)顯色，圖像分析軟件掃描條帶灰度值，Western blotting法計算兩種組織中蛋白表達相對定量，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。EZH2蛋白表達陽性率及其與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗，EZH2和Caspase-3相關性分析采用Spearman相關分析法，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織中EZH2及Caspase-3蛋白表達及其與患者臨床病理特征的關系 胰腺癌組織、癌旁組織中EZH2蛋白陽性表達率分別為84%、6%，胰腺癌組織、癌旁組織中EZH2蛋白陽性表達率比較，P<0.05。EZH2蛋白陽性表達與結直腸癌患者性別、年齡無關(P均>0.05)，與患者腫瘤部位、組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移有關(P均<0.05)。Caspase-3蛋白在胰腺癌及癌旁組織中的陽性表達率分別為37%、92%，胰腺癌組織、癌旁組織中Caspase-3蛋白陽性表達率比較，P<0.05。Caspase-3蛋白陽性表達與結直腸癌患者性別、年齡、腫瘤部位無關(P均>0.05)，與組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移有關(P均<0.05)，見表1、表2。

表1 EZH2蛋白陽性表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

表2 Caspase-3蛋白陽性表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

2.2 結直腸癌患者癌組織中EZH2與Caspase-3蛋白表達的關系 Caspase-3蛋白與EZH2蛋白共同陽性例數(shù)為23例(23.00%)，共同陰性例數(shù)為6例(6.00%)。Spearman相關性分析顯示，EZH2與Caspase-3蛋白表達呈負相關(r=-0.64，P<0.01)。

3 討論

近年來，PcG基因家族成為研究的熱門基因之一，在多個生物學過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[8]。EZH2是PcG基因家族中的一員，PcG基因和TrxG相互拮抗則會引起功能失調(diào)，導致癌變。EZH2定位于人類7號染色體的q35區(qū)域，小鼠6號染色體位置上，是一種致癌基因[9]。既往研究表明，EZH2在多種實體腫瘤組織(如胰腺癌等)中異常表達，與預后差密切相關[6]。Mimori等[10]研究表明，結直腸癌病例中EZH2豐富表達。EZH2基因是Polycomb基因組的成員，參與表觀遺傳沉默和細胞周期調(diào)控，其表達與細胞增殖有密切關系。一項409例結直腸癌Ⅰ期和Ⅲ期患者的研究結果表明，EZH2表達與腫瘤細胞增殖有關[11]。盡管EZH2蛋白在結直腸腺癌中的表達不斷見諸報道，但目前EZH2在結直腸癌中的作用機制仍不清楚。

本研究結果顯示結直腸腺癌組織中EZH2蛋白陽性表達高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義。另外，EZH2蛋白表達與結直腸腺癌分化程度及分期密切相關，隨著分化程度增加而表達升高，差異有統(tǒng)計學意義。另外，左半結腸與右半結腸的EZH2蛋白表達亦有統(tǒng)計學差異，表明左右半結腸的癌變機制亦存在一定差異[12]。結直腸腺癌組織中Caspase-3蛋白表達低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義。Caspase-3蛋白表達與結直腸腺癌患者腫瘤部位無關，而與組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移有關。EZH2蛋白及Caspase-3蛋白的異常表達可作為臨床早期診斷結直腸腺癌的參考指標。

如前所述，EZH2基因表達與細胞增殖有關。然而Caspase-3作為參與細胞凋亡的重要基因，與EZH2相互作用機制尚不明確。Mimori等[10]研究表明EZH2高表達組結直腸腺癌患者預后顯著差于低表達組，而Fluge等[11]研究表明EZH2高表達與細胞增殖呈正相關，具有更好的無復發(fā)生存時間。本研究結果顯示，EZH2與Caspase-3表達呈相反的趨勢，高分化結直腸腺癌組織具有高表達的EZH2和低表達的Caspase-3。另外，Spearman相關性分析結果亦證明二者呈負相關關系。小干擾RNA下調(diào)人結腸癌細胞 中EZH2基因表達后，細胞凋亡比例增加，細胞增殖能力明顯降低[13]。本研究結果表明EZH2蛋白與結直腸腺癌細胞凋亡密切相關。

總之，結直腸腺癌組織中EZH2蛋白呈高表達，Caspase-3蛋白呈低表達；EZH2可能通過下調(diào)Caspase-3表達，進而影響腫瘤細胞的增殖，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

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周毅(E-mail:JJ＿158@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.015

R735.3

B

1002-266X(2017)25-0048-03

2016-12-27)