結直腸癌組織中Tip60蛋白的表達變化及意義

亓飛(新汶礦業集團有限責任公司萊蕪中心醫院，山東萊蕪 271103)

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結直腸癌組織中Tip60蛋白的表達變化及意義

亓飛
(新汶礦業集團有限責任公司萊蕪中心醫院，山東萊蕪 271103)

目的 觀察結直腸癌組織中Tip60蛋白的表達變化，并探討其意義。方法 選取結直腸癌患者80例，采用免疫組化法檢測結直腸癌組織、癌旁正常組織中Tip60蛋白表達，經MTT藥敏試驗檢測結直腸癌癌細胞對阿糖胞苷、氟尿嘧啶、絲裂霉素、伊利替康和奧沙利鉑五種化療藥物的敏感性。結果 癌旁正常組織、結直腸癌組織中Tip60蛋白陽性表達率分別為75%、25%，兩者比較，P<0.05。Tip60蛋白表達與結直腸癌患者腫瘤大小、臨床分期及分化程度有關(P均<0.05)。Tip60表達下調使結直腸癌對化療藥物絲裂霉素、伊立替康和奧沙利鉑的敏感性提高(P均<0.05)。結論 結直腸癌組織中Tip60表達下調，Tip60可作為預測結直腸癌預后及化療的生物學指標。

結直腸癌；Tip60蛋白；藥敏試驗

我國結直腸癌發病率逐年升高，現居惡性腫瘤發病率的第四位[1，2]。Tip60蛋白是酵母雙雜交技術篩選出的能輔助Tat蛋白對HIV基因進行調節的物質，其相對分子質量為60×103Da,在細胞凋亡、DNA修復及細胞信號傳導中均發揮重要作用[3]。目前，惡性腫瘤與Tip60基因突變、轉錄及翻譯改變的關系已有大量研究，但結直腸癌組織中Tip60表達與腫瘤化療的關系鮮見報道。2012年6月～2015年6月,我們觀察了結直腸癌組織中Tip60蛋白表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 結直腸癌患者80例，均經病理檢查確診。均行結直腸癌根治術切除標本，取癌組織80例份，相應癌旁(距離癌組織5 cm)組織80例份。患者中男45例、女35例，年齡38～82(59.8±6.5)歲。臨床病理分期(國際抗癌聯盟UICC和美國腫瘤聯合會AJCC聯合改良版Duke′s分期)：A期8例，B期12例，C期18例，D期42例；淋巴結轉移42例，無轉移38例；高分化腺癌18例，中分化腺癌38例，低分化腺癌24例；原發病灶部位：升結腸18例，橫結腸12例，降結腸10例，乙狀結腸27例，直腸13例。

1.2 癌及癌旁組織中Tip60蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取出蒸餾水中的切片，甩掉并擦干切片上組織周圍的液體，平放于濕盒中，滴加過氧化物酶阻斷劑(3%過氧化氫)在組織上避光孵育15 min。蒸餾水沖洗，再將切片放入TBS或PBS緩沖液中，浸泡5 min，3次，取出切片滴加50～100 mL的一抗(兔抗人Tip60多克隆抗體1∶150)工作液于組織上，室溫下孵育30 min，滴加50～100 mL A工作液(ChemMate Envision+/HRP)于組織上，室溫下孵育30 min。滴加預備好的顯色劑DAB工作液50～100 mL，室溫孵育5～10 min，或光鏡下控制顯色。顯色完全后，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染。各級乙醇(70%～100%)脫水，每級3 min。取出切片放入二甲苯5 min，3次。用封片膠封片。Tip60位于細胞核，免疫組化陽性呈棕黃色信號，陽性細胞計分標準參照文獻[4]。分級計分標準參照文獻[5]；兩者計分相乘≥1判定為陽性。

1.3 藥液配制、細胞培養及MTT藥敏試驗 藥物液配制參照文獻[6]：按照公式Cmax=D(mg)/5 000×2×10 mg/L(血漿)，對藥物一次快速靜脈注射后的理論最高藥物濃度；經配制各類藥物最終的濃度：阿糖胞苷220 mg/L，氟尿嘧啶320 g/L，絲裂霉素2.8 mg/L，伊利替康58 mg/L，奧沙利鉑85 mg/L；均使用生理鹽水稀釋為工作液。MTT藥敏試驗：使用96孔細胞培養板，設置實驗孔、對照孔和空白孔，每組復種3孔；其中對照孔(細胞懸液90 μL+生理鹽水10 μL)，空白孔(無細胞培養基90 μL+生理鹽水10 μL)，實驗孔(細胞懸液90 μL+化療藥物10 μL)；將新鮮結直腸癌組織泡入PBS緩沖液中(鏈霉素500 mg/L，青霉素800 mg/L，兩性霉素5 mg/L)，表面出血及壞死修去后，使用PBS緩沖液進行清洗，修剪癌組織體積為1 mm3，胰蛋白酶消化4 h(37 ℃)，鋼篩過濾，細胞濃度控制為(2～5)×105/mL。將細胞置入細胞培養箱中培養48 h，加入MTT生理鹽水稀釋液5 g/L，20 μL/孔；繼續培養4 h后加入10%十二烷基硫酸鈉100 μL/孔；采用酶聯免疫檢測儀對各孔光密度(OD)值進行測定，細胞生長抑制率計算參照文獻[7]：抑制率=(對照孔OD-實驗孔OD)/(對照孔OD-空白孔OD)。體外藥敏判定標準[8]：敏感：抑制率≤50%。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件。率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌及癌旁組織中Tip60蛋白表達比較 結直腸癌組織中Tip60蛋白陽性表達于細胞核；癌旁正常組織中Tip60蛋白陽性表達于腺上皮細胞核。癌旁正常組織、結直腸癌組織中Tip60蛋白陽性表達率分別為75%、25%，兩者比較，P<0.05。

2.2 Tip60蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系 Tip60蛋白表達與結直腸癌患者的腫瘤大小、臨床分期及分化程度有關(P均<0.05)。詳見表1。

2.3 Tip60蛋白表達與腫瘤化療的關系 Tip60表達下調可使結直腸癌對化療藥物絲裂霉素、伊立替康和奧沙利鉑的敏感性提高(P均<0.05)，但對阿糖胞苷和氟尿嘧啶無明顯影響(P均>0.05)。詳見表2。

表1 Tip60蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

3 討論

目前，手術與化療是治療結直腸癌的主要方法，而結直腸癌對化療的耐藥現象是影響臨床治療效果的重要因素[8]。因此，探究腫瘤耐藥機制，尋求化療的敏感指標，制定個體化治療方案，對結直腸癌療效的提升有重要意義。文獻[9，10]報道，Tip60可促使核苷酸切除修復交叉互補組1蛋白的表達上調，核苷酸切除修復交叉互補組1蛋白和順鉑引起的DNA損傷存在緊密聯系。Tip60可使U20S細胞對電離輻射的敏感性提高，表明腫瘤放化療敏感性與Tip60表達關系密切。Tip60在細胞凋亡、基因轉錄、DNA損傷修復中起重要作用，其在腫瘤發生及進展方面研究相對較多。國外學者應用實時定量PCR對腫瘤組織與正常組織中的Tip60基因轉錄水平進行檢測，發現與正常組織相比，結腸癌和肺癌組織中Tip60基因轉錄水平下調[11]；有關研究[12]借助組織芯片技術發現轉移性惡性黑色素瘤中，Tip60表達較原發惡性黑色素瘤、發育不良痣下調，而抑制Tip60表達有促進惡性黑色素瘤細胞轉移的作用。另有文獻[13]報道，膀胱癌中Tip60表達下調，且與患者腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移等呈負相關。

表2 Tip60蛋白表達與腫瘤化療的關系

本研究結果顯示，結直腸癌組織中Tip60蛋白表達較癌旁正常組織低，與腫瘤大小、臨床分期、分化程度有關,提示結直腸癌的發生發展與Tip60蛋白表達下調有關。本研究結果還顯示，Tip60表達下調能顯著提高結直腸癌對化療藥物奧沙利鉑、伊立替康及絲裂霉素的敏感性，而對氟尿嘧啶及阿糖胞苷無影響。這可能與化療藥物的作用機制有關。奧沙利鉑參與細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡，伊立替康抑制DNA 拓撲異構酶，干擾DNA 復制，絲裂霉素通過烷化作用引起DNA損傷，而上述過程均可有Tip60的參與，故Tip60表達改變能影響以上藥物的作用，而氟尿嘧啶及阿糖胞苷主要作用機制是抑制DNA 的合成，Tip60表達改變對它們影響不大。

綜上所述，結直腸癌組織中Tip60表達下調；Tip60蛋白表達與腫瘤大小、臨床分期及分化程度有關。Tip60表達下調使結直腸癌對化療藥物絲裂霉素、伊立替康和奧沙利鉑的敏感性提高，其可作為預測結直腸癌預后及化療的生物學指標。

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