廣西崇左地區(qū)壯族早發(fā)性乳腺癌復(fù)發(fā)患者癌組織中BRCA1、BRCA2的表達(dá)變化

林國鴻，農(nóng)文偉，羅強(qiáng)，周增華(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院·廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院，南寧530007；廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

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廣西崇左地區(qū)壯族早發(fā)性乳腺癌復(fù)發(fā)患者癌組織中BRCA1、BRCA2的表達(dá)變化

林國鴻1，農(nóng)文偉1，羅強(qiáng)1，周增華2
(1廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院·廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院，南寧530007；2廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

目的 觀察廣西崇左地區(qū)壯族早發(fā)性乳腺癌復(fù)發(fā)患者癌組織中BRCAI與BRCA2表達(dá)變化。方法 采用熒光定量PCR和Western blotting法檢測30例首診早發(fā)性乳腺癌患者(A組)癌和癌旁組織標(biāo)本、30例早發(fā)性乳腺癌復(fù)發(fā)患者(B組)癌和癌旁組織標(biāo)本、10例乳腺增生患者(C組)標(biāo)本中BRCA1與BRCA2 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果 與C組比較，A、B組癌和癌旁組織標(biāo)本BRCA1、BRCA2 mRNA與蛋白表達(dá)均下降(P均<0.05)；與A組比較，癌及癌旁組織標(biāo)本中BRCA1、BRCA2 mRNA與蛋白表達(dá)均下降(P均<0.05)；A組BRCA1 mRNA與蛋白在癌組織中表達(dá)量高于癌旁組織(P均<0.05)，RRCA2 mRNA與蛋白在癌組織及癌旁組織中表達(dá)程度無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；B組BRCA1、BRCA2 mRNA與蛋白在癌組織中表達(dá)量均低于癌旁組織(P均<0.05)。結(jié)論 廣西崇左地區(qū)壯族早發(fā)性乳腺癌復(fù)發(fā)患者癌組織中BRCA1與BRCA2均持續(xù)性低表達(dá)，二者可能是乳腺癌復(fù)發(fā)的重要因素。

乳腺癌；乳腺癌易感基因；腫瘤復(fù)發(fā)；廣西壯族；崇左地區(qū)

我國每年女性乳腺癌發(fā)病例數(shù)達(dá)16.9萬，占全球總發(fā)病數(shù)的12.25%，高居全球第二[1]，是第二位最常見女性惡性腫瘤，亦是女性第六位最常見的惡性腫瘤死亡原因[2]。乳腺癌是臨床較易治療的腫瘤，導(dǎo)致患者死亡的原因是不可控的病情復(fù)發(fā)，而誘導(dǎo)患者腫瘤細(xì)胞再次惡性增殖的機(jī)制目前仍不清楚。目前，基因檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中有高達(dá)289個基因表達(dá)改變，涉及39個蛋白功能異常[3]。在遺傳性乳腺癌中，60%～75%是與高外顯性的乳腺癌易感基因1/2(BRCA1/2)突變所致[4]。研究發(fā)現(xiàn)，中國廣東漢族早發(fā)性乳腺癌患者的BRCA1和BRCA2基因異常[5]，而廣西地區(qū)散發(fā)性乳腺癌患者BRCA異常表達(dá)率約為90.0%[6]。但BRCA1和BRCA2在廣西地區(qū)壯族早發(fā)性乳腺癌患者治愈后復(fù)發(fā)是否與BRCA1/2異常表達(dá)有關(guān)，目前尚未見相關(guān)報道。2010年3月～2016年3月，我們觀察了廣西崇左地區(qū)壯族早發(fā)性乳腺癌復(fù)發(fā)患者中BRCA1與BRCA2表達(dá)變化。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院普外科收治的早發(fā)性乳腺癌患者30例(A組)，年齡<35歲。腫瘤直徑低于2 cm、組織學(xué)分級3級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0期內(nèi)、組織學(xué)類型：浸潤性非特殊癌。早發(fā)性乳腺癌復(fù)發(fā)患者30例(B組)，年齡<35歲。腫瘤直徑低于2 cm、組織學(xué)分級3級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0期內(nèi)、組織學(xué)類型：浸潤性非特殊癌。早發(fā)性乳腺癌與復(fù)發(fā)性乳腺癌納入標(biāo)準(zhǔn)參考2015版《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范》：①患者年齡均≤35歲；②疾病最終診斷以術(shù)中切取病變組織進(jìn)行病理學(xué)檢測結(jié)果為準(zhǔn)，受試者均為浸潤性非特殊癌；③臨床分期Ⅲb期以下；④早發(fā)與復(fù)發(fā)均在本院治療。乳腺增生患者10例(C組)，年齡<50歲。為排除可疑惡變且經(jīng)患者同意后，穿刺取病理組織活檢確診的患者。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院人體醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員批準(zhǔn)，術(shù)前簽署標(biāo)本處理知情同意書。

1.2 乳腺癌、癌旁及乳腺增生組織中BRCA1、BRCA2 mRNA表達(dá)檢測 采用熒光定量PCR法。乳腺癌、癌旁及乳腺增生組織術(shù)中或診斷穿刺無菌提取后液氮速凍后轉(zhuǎn)運至-80 ℃冰箱保存。取出腫瘤組織，冰上超聲勻漿機(jī)研磨，參照TRIzol法提取總RNA，用ddH2O稀釋1 μL樣品200倍后測定RNA濃度與純度。引物由Primer軟件設(shè)計、Takara公司合成，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，42 ℃反轉(zhuǎn)錄50 min，95 ℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。使用ABI 7300 Real-Time PCR System進(jìn)行Syber Green 熒光定量PCR檢測，其反應(yīng)體系為 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2X)12.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL和dH2O 8.5 μL，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。mRNA采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。BRCA2上游引物：5′-CTTGCCCCTTTCGTCTATTTG-3′，下游引物：5′-TACGGCCTGAAGTACAGTCTT-3′，退火溫度60 ℃；BRCA1上游引物：5′-CCCATTTTCCCCCGCAT-3′，下游引物：5′-GGACCTTGGTGGTTTCT3-3′，退火溫度54 ℃；GADPH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′，退火溫度64 ℃。

1.3 癌及癌旁組織中BRCA1、BRCA2 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取出凍存標(biāo)本，采用含蛋白酶抑制劑的組織裂解液RIP后置于冰盒進(jìn)行超聲勻漿，12 000 r/min離心30 min后取上清液，使用BCA標(biāo)準(zhǔn)蛋白測定法測定并記錄各組總蛋白濃度。加上樣緩沖液后沸水浴5 min，取40 μg總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠分離，在冰水混合液環(huán)境中40 V恒壓將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%的脫脂奶粉封閉2 h，TBST漂洗后加入BRCA1和BRCA2一抗，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜3次后加入二抗37 ℃ 2 h。TBST清洗后在Image Lab系統(tǒng)下成像并計算目的條帶灰度值，以GAPDH為上樣量的內(nèi)參，計算目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

三組BRCA1、BRCA2 mRNA表達(dá)比較見表1,三組BRCA1、BRCA2蛋白表達(dá)比較見圖1、表2。與C組比較，A、B組癌組織與癌旁組織中BRCA1和BRCA2蛋白及其mRNA均表達(dá)下調(diào)(P均<0.05)；與A組比較，B組BRCA1和BRCA2蛋白及其mRNA表達(dá)量更低(P均<0.05)；A組BRCA1蛋白及其mRNA在癌組織中表達(dá)量顯著低于癌旁組織(P均<0.05)，而BRCA2蛋白及其mRNA則在二者中表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；B組BRCA1、BRCA2蛋白及其mRNA在癌組織中表達(dá)量低于癌旁組織(P均<0.05)。

3 討論

乳腺癌是最常見的非皮膚癌和婦女癌癥死亡的首要原因[8]。女性乳腺癌發(fā)病率在2000年開始下降，但隨著人口老齡化和癌癥風(fēng)險因素在現(xiàn)代生活方式中的表現(xiàn)恢復(fù)到上升趨勢[9]，其重要的原因是乳腺癌復(fù)發(fā)后病情難以控制，但導(dǎo)致這種復(fù)發(fā)現(xiàn)狀的機(jī)制仍在探究中。BRCA1是一種存在于每個人體內(nèi)的抑癌基因，其合成的蛋白主要負(fù)責(zé)修復(fù)斷裂DNA，維持基因組穩(wěn)定性[10]。BRCA1基因失活或故障則是家族性及散發(fā)性乳腺癌發(fā)病的重要原因，BRCA1突變攜帶者患乳腺癌的風(fēng)險高達(dá)85%[11]。結(jié)合本研究中復(fù)發(fā)患者，推測BRCA1是導(dǎo)致早發(fā)性乳腺癌復(fù)發(fā)的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致BRCA1基因失活或故障的重要機(jī)制之一是基因水平的甲基化修飾[12]，尤其是啟動子的甲基化程度與腫瘤預(yù)后生存質(zhì)量負(fù)相關(guān)[13]，因此本研究中復(fù)發(fā)癌組織BRCA1 mRNA表達(dá)進(jìn)一步受到抑制。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1甲基化活性降低的程度與腫瘤分期和大小之間存在相關(guān)性[14]，這可能是本研究中復(fù)發(fā)患者BRCA1蛋白及mRNA水平較初發(fā)患者表達(dá)量更低的原因。

表1 各組標(biāo)本中BRCA1 mRNA與BRCA2 mRNA表達(dá)比較

注：與C組比較，﹡P<0.05；與A組比較，﹟P<0.05；與同組癌組織比較，△P<0.05。

組別nBRCA1蛋白癌組織(增生組織)癌旁組織BRCA2蛋白癌組織(增生組織)癌旁組織C組101．10±0．11-1．31±0．34-A組300．68±0．22﹡0．87±0．26△0．61±0．17﹡0．58±0．07B組300．23±0．02﹡﹟0．14±0．03﹟△0．36±0．06﹡﹟0．14±0．03﹟△

注：與C組比較，﹡P<0.05；與A組比較，﹟P<0.05；與癌組織比較，△P<0.05。

BRCA2與BRCA1基因一樣結(jié)構(gòu)上存在差異，但均在乳腺癌和其他組織細(xì)胞中表達(dá)，在DNA雙鏈斷裂的無差錯修復(fù)中起重要作用，當(dāng)DNA不能修復(fù)則破壞細(xì)胞[15]。BRCA2發(fā)生突變時，則BRCA2基因受到破壞，這種修復(fù)DNA的能力喪失則增加患乳腺癌風(fēng)險[16]。正常狀態(tài)下，BRCA2表達(dá)于細(xì)胞核參與染色體修復(fù)，發(fā)生惡變時則聚集分布于細(xì)胞質(zhì)中。與BRCA2致病機(jī)制不同的是，BRCA1錯位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，則與核定位信號異常有關(guān)[17]。應(yīng)注意的是，在早發(fā)性乳腺癌中，盡管癌組織與癌旁組織中BRCA2均表達(dá)下調(diào)，但二者比較并無統(tǒng)計學(xué)差異。相對于復(fù)發(fā)癌組織中，BRCA2基因表達(dá)增加。這種在早期腫瘤過表達(dá)可能反映細(xì)胞代償以此提高同源重組修復(fù)多余的DNA損傷[18]。在復(fù)發(fā)性癌組織，BRCA2 mRNA和蛋白水平均低于正常組織，提示BRCA2不可代償?shù)南抡{(diào)導(dǎo)致不可修復(fù)的缺損DNA導(dǎo)致癌細(xì)胞增加，這為乳腺癌復(fù)發(fā)的可能機(jī)制提供了一個方向。

本研究結(jié)果提示，BRCA1蛋白及其mRNA在癌組織中表達(dá)量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而BRCA2蛋白及其mRNA則在二者中表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，提示BRCA1轉(zhuǎn)錄與表達(dá)抑制可能是早發(fā)性乳腺癌發(fā)病的重要因素，且BRCA1和BRCA2蛋白及其mRNA在癌組織中表達(dá)量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示BRCA1和BRCA2均與早發(fā)性乳腺癌的復(fù)發(fā)密切相關(guān)。但本研究納入的觀察病例數(shù)較少，尚不能完全解釋可能機(jī)制。同時研究停留于觀察階段，對病例中BRCA1和BRCA2改變的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，BRCA1和BRCA2受地域、民族影響，在人群中表達(dá)存在一定程度差異。通過比較崇左壯族人群中的早發(fā)性乳腺癌和復(fù)發(fā)性乳腺癌的腫瘤組織和癌旁組織中BRCA1、BRCA2的mRNA、蛋白水平，推測BRCA1和BRCA2低表達(dá)不僅是早發(fā)性乳腺癌的發(fā)病因素，二者持續(xù)性降低還是早發(fā)性乳腺癌治愈后復(fù)發(fā)的可能重要原因，此為本地區(qū)早發(fā)性乳腺癌的防治提供了參考。

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農(nóng)文偉(E-mail：nwwone@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.021

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1002-266X(2017)25-0064-03

2017-02-20)