基于CRISPR/Cas9技術構建豬miR-136基因編輯載體

孫士梅，劉 暢，牛 熙，黃世會，王嘉福*，冉雪琴*

(1．貴州大學 農業生物工程研究院，貴州 貴陽 550025；2．貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

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·研究報告·

基于CRISPR/Cas9技術構建豬miR-136基因編輯載體

孫士梅1，劉 暢1，牛 熙1，黃世會2，王嘉福1*，冉雪琴2*

(1．貴州大學 農業生物工程研究院，貴州 貴陽 550025；2．貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

為了闡明microRNA對豬產仔數的調節機制，采用CRISPR/Cas 9技術構建針對豬miR-136的基因編輯表達載體。通過實驗，在miR-136基因成熟區及其下游設計兩個單鏈引導RNA(sgRNA)，合成4條磷酸化的單鏈DNA寡核苷酸，復性后形成兩條帶粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段，插入線性化的載體pX462的BpiI酶切位點處，轉化感受態大腸桿菌DH5α，經測序確認，得到兩個編輯表達載體pX462-miR-136-1和pX462-miR-136-2。構建了兩個編輯miR-136基因的表達載體，為豬繁殖力的調控研究奠定了技術基礎。

豬；CRISPR/Cas 9技術；miR-136基因；sgRNA；基因編輯

CRISPR/Cas9技術是一種新型的基因編輯技術。1987年，日本大阪大學研究人員首次發現，大腸桿菌堿性磷酸酶基因的編碼區附近含有簡單重復序列組成的特殊DNA序列，在單個重復序列之間還插入了間隔序列(space DNA)[1]。隨后發現這種間隔成簇短回文重復序列存在于大部分細菌和古細菌中，于2002年被正式命名為“CRISPR/Cas”系統。Cas9是Ⅱ型CRISPR/Cas系統新研發的介導目標DNA切割的核酸酶[2]。2012年，來自霍華德·休斯醫學研究所的研究人員發現Cas9蛋白是在crRNA(CRISPR RNA)與tracrRNA(trans-activating chimeric RNA)配對形成的RNA異二聚體的介導下切割目標DNA，他們將這種RNA異二聚體改造為融合成一條sgRNA，以指導Cas9蛋白對靶DNA序列的剪切，從而發展出了CRISPR/Cas9技術[3]。CRISPR是一種來自細菌降解入侵的病毒DNA或外源DNA的免疫機制。在該機制中，Cas蛋白含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割兩條DNA鏈。一旦與crRNA和tracrRNA結合形成復合物，Cas蛋白發揮核酸酶活性對復合物中的DNA進行切割，造成DNA雙鏈斷裂，從而使入侵的外源DNA降解[4]。該技術已經被運用于構建斑馬魚基因敲除細胞系[5]和小鼠動物模型[6]。

MicroRNA是一類非編碼的單鏈小RNA，長度21-25 nt，由70-90 nt并具有發夾結構的單鏈前體RNA(pre-miRNA)經過Dicer酶的加工形成，通過堿基互補配對與靶mRNA分子的3′-端非編碼區(3′-untranslated region，3′-UTR)結合，進而抑制mRNA的后期翻譯[7]。MicroRNA在繁殖相關的基因表達、細胞分化等生命活動中起重要的調控作用。

我們在研究豬基因組重測序數據中，從7號染色體132018348-132081671位置發現一個大片段的缺失，經基因注釋其中包含miR-136基因。研究發現miR-136的靶基因LHR等對動物的睪丸和卵巢功能起作用[8，9]。為了探索miR-136對豬的繁殖力是否具有調節作用，本文應用CRISPR/Cas9技術構建豬miR-136的基因編輯表達載體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株 CRISPR/Cas9n質粒pSpCas9n(BB)-2A-Puro (pX462) V2.0(#62987)購自Addgene公司，質粒圖譜可于http：//www.addgene.org/62987/網站查詢。感受態細胞DH5α由貴州大學農業生物工程重點實驗室保藏菌株。

1.1.2 試劑 Fast DigestBpiI、FastAP、10×FastDigest Buffer(Green)購自Thermo 公司；Plasmid Safe exonuclease、10×Plasmid Safe Buffer、10 mmol/L ATP購自Epicentr公司：2×T4Ligation Buffer、T4DNA ligase購自Promega公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。1.1.3 引物合成與測序 寡鏈核苷酸(oligo)DNA和引物合成以及測序由上海英濰捷基有限公司完成。1.2 方法

1.2.1 sgRNA oligo序列的設計 根據http：//www.mirbase.org/網站確定miR-136基因序列(圖1)；根據http：//crispr.mit.edu/網站設計在miR-136基因序列的成熟區和前體區設計sgRNA序列。sgRNA設計的原則：靶點前面為轉錄起始信號G，靶點的后面為PAM序列NGG，在其兩端加上酶切位點；根據Target Sequence Cloning Protocol標準，在每條sgRNA序列F鏈的5′端添加CACC，R鏈的5′端添加AAAC，與pX462質粒經BpiI酶切后形成的粘性末端互補。如F鏈的5′端第一個堿基不是G，則在5′端CACC下游添加一個G，相應地R鏈的3′端再增加一個C(表1)。

表1 miR-136 sgRNA oligo和檢測引物序列

注：oligo序列上游的酶切位點用小寫字母表明，添加的堿基G和C加粗并下劃線。

圖1 miR-136基因前體序列

Fig.1 miR-136 gene precursor sequence

注：下劃線的堿基是miR-136成熟區

1.2.2 重組質粒pX462-miR136-1和pX462-miR136-2的構建 用BpiI對pX462質粒進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收線性化的載體。對oligo1、oligo2進行磷酸化修飾和退火。用T4DNA連接酶將線性的pX462載體分別與退火后的oligo1、oligo2連接，反應條件：37℃水浴30 min，16℃連接6-8 h。連接產物轉化感受態細胞DH5α，在含氨芐青霉素抗性的LB固體平板上篩選克隆。在pX462載體插入位點的外圍設計一對引物UpX462和DpX462(表1)，用于篩選陽性菌落。挑取陽性克隆擴大培養，測定插入片段的堿基序列。

圖2 重組質粒pX462-miR136的構建流程

注：A是oligo1磷酸化和退火得到的插入片段；B是oligo2磷酸化和退火得到的插入片段；C是插入片段與線性的pX462載體連接的模式圖；D是構建的重組質粒模式圖。

2 結果與分析

2.1 oligo1、oligo2的磷酸化和退火

合成oligoF1/R1、oligoF2/R2時分別在單鏈DNA的5’端增加了磷酸基團修飾。兩條單鏈以1∶1比例混合，在90℃下孵育10 min，室溫下自然冷卻復性1～2 h。得到雙鏈的寡核酸片段oligo1、oligo2，瓊脂糖電泳檢測，條帶與預期大小相符(圖3)。

圖3 雙鏈的寡核酸片段oligo1、oligo2的檢測

注：M為DNA分子量；1泳道是oligo1退火得到的目的片段；2泳道是oligo2退火得到的目的片段。

2.2 pX462質粒酶切

質粒pX462上有BpiI(BbsI)酶切位點(圖4)，應用BpiI酶切斷質粒并去磷酸化，得到線性化的載體。瓊脂糖電泳檢測約為9 kb，與預期大小一致(圖5)。

圖4 pX462質粒圖譜

注：箭頭是BbsI的識別位點。

圖5 pX462質粒BbsI酶切鑒定

注：M為DNA分子量；1泳道是pX462質粒；2、3泳道是pX462酶切。

2.3 重組質粒pX462-miR136-1和pX462-miR136-2構建

重組質粒pX462-miR136的構建流程如圖2所示，按3∶1的比例分別將得到的一對雙鏈的寡核酸片段與線性化載體pX462連接，轉化大腸桿菌DH5α，以UpX462/DpX462引物進行PCR檢定，得到2#與4#克隆擴增出與預期大小一致的目的片段(圖6)。經測序驗證(圖7、8)，在重組質粒的BpiI酶切位點處插入了oligo1和oligo2片段，方向和堿基序列與預期一致，證實oligo1、oligo2正確插入了pX462質粒中，得到重組質粒pX462-miR136-1和pX462-miR136-2。

圖6 重組質粒菌落PCR鑒定

注：M為DNA分子量；1泳道是pX462質粒；2泳道是pX462-miR136-1；4泳道是pX462-miR136-2；3、5、6、7泳道陰性克隆。

圖7 重組質粒pX462 -miR-136-1測序結果

注：方框是插入的正確片段

圖8 重組質粒pX462 -miR-136-2測序結果

注：方框是插入的正確片段

3 結論與討論

本文應用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了miR-136基因編輯的表達載體。應用CRISPR/Cas9基因編輯技術以實現對靶基因的敲除，選擇靶基因的識別序列(sgRNA識別序列)是第一步。根據II型CRISPR/Cas9系統的生物學性質，目標基因的識別序列需要是一段20 bp左右的DNA序列，在序列末端緊鄰PAM三聯核苷酸結構(NGG或者NAG，N代表任何堿基)[10]。本文根據miRNA的作用機理，按照靶點的設計原則，選擇miR-136成熟區種子序列與前體序列兩個位置[11]，設計兩條sgRNA，其靶點序列的間距是0～20 bp[12]。

Cas9核酸內切酶有HNH和RuvC兩個活性位點，切割后斷裂雙鏈DNA，誘發基因組DNA啟動同源重組或非同源末端連接機制進行DNA雙鏈的修復，修復過程中可能產生堿基的插入或缺失，改變基因的結構引起突變[13]。CRISPR/Cas9的特異性與跟sgRNA配對且靠近PAM處的7～12 bp有關，因此CRISPR/Cas9的靶向特異性非常低[14]。Ran等將Cas9在RuvC催化位點進行了突變，改造成在sgRNA互補鏈制造單鏈切口的切口酶(Cas9n)，由一對sgRNA分別引導來實現靶位點的切割，此方法能顯著提高基因的敲除效率[15]。

本研究選用改良的pX462質粒，該質粒是為含U6啟動子的sgRNA骨架表達載體，表達具有Cas9 D10A切口酶突變的Cas9n(單鏈切口的核酸酶Cas9)。在酶切pX462質粒時，應用20 uL酶切體系，加入2IU酶(BbsI)，10分鐘的效果最佳，與插入片段進行連接，轉化時效率比較高。成功構建的兩個重組表達載體pX462-miR-136-1和pX462-miR-136-2為下一步轉染豬繁殖細胞系中奠定了基礎。

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Construction of Gig miR-136 Gene Editing Vector Based on CRISPR/Cas9 Technique

SUNShi-mei1，LIUChang1，NIUXi1，HUANGShi-hui2，WANGJia-fu1*，RANXue-qin2*

(1.InstituteforAgriculturalBioengineeringofGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.FacultyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

The present paper aims to explore the molecular mechanism of microRNA on the litter size of pig. The expressed vector to edit the miR-136 gene was constructed using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) and associated nuclease Cas9 (CRISPR/Cas9) technique. A pair of single guide RNAs (sgRNA) were designed at the miR-136 gene mature sequence and its downstream location based on the precursor of pig miR-136. Four single DNA oligonucleotides were synthesized with a phosphorylation on each strand of the 5`-end, and annealed into two double-strand oligo fragments: oligo 1 and oligo 2. Both of these oligos were inserted into theBpiIsite of plasmid pX462, respectively. After transforming into competent DH5α, the sequences of inserts were confirmed for the two recombinant plasmids as pX462-miR-136-1 and pX462-miR-136-2. Two expression vectors for miR-136 gene editing were constructed, which would be useful for the research of fecundity in pig.

pig; CRISPR/Cas9 technique; miR-136 gene; sgRNA; gene editing

2017-03-08；

2017-05-10

國家高技術研究發展計劃(863計劃)課題(2013AA102503)；貴州省農業攻關項目(黔科合NY[2013]3073號)；貴州省“百”層次創新型人才項目(黔科合人才2016-4012號)；國家自然科學基金(31672390)。

文獻標識碼：A

1008-0457(2017)04-0009-04 國際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.04.002

*通訊作者：王嘉福(1962-)，男，教授，主要研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail：jfwang@ gzu.edu.cn； 冉雪琴(1967-)，女，教授，主要研究方向：動物生理與分子生物學；E-mail：xqran@ gzu.edu.cn。