HerpesSimplexVirusType1感染SH—SY5Y細胞與Aβ1—42誘導SH—SY5Y細胞AD模型比較

徐曉艷　封玉玲　李小山

【摘要】目的：探討HSV-1感染SH-SY5Y細胞后，與Aβ1-42誘導的SH-SY5Y細胞模型的病理差異。方法：建立HSV-1感染和Aβ1-42作用的SH-SY5Y細胞模型，同時設立未加干預的正常對照組，RT-PCR的方法檢測炎癥因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）在mRNA的表達水平，Western blot檢測炎癥通路相關蛋白（BDNF、NF-κB、Cox-2、TNF-α、iNOS）的表達水平，對比差異。結果：與正常對照組相比HSV-1感染組和Aβ1-42模型組有顯著差異（p<0.05），HSV-1感染組與Aβ1-42模型組相比有著較為一致的變化趨勢。結論：HSV-1感染SH-SY5Y細胞也會導致與AD細胞模型相同的通路損傷，HSV-1的感染可能是導致AD的潛在因素之一。

【關鍵詞】HSV-1；AD ；Aβ1-42；SH-SY5Y細胞；NF-κB炎癥通路

【中圖分類號】R786 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）07-0-01

Herpes Simplex Virus Type 1（單純皰疹病毒1型）是中樞神經系統感染的常見病原體，引起宿主的局灶性壞死性腦炎，臨床預后差，患者會遺留有不同程度的神經功能損傷[1]。阿爾茨海默癥（Alzheimer' s disease，AD），又稱老年癡呆，是常見的中樞神經系統退行性變，以認知功能障礙為主要臨床表現，隨著人口老齡化的增長，此病的發病率繼續成上升趨勢，成為人類的一大負擔[2]。本實驗以此為基礎，HSV-1感染SH-SY5Y細胞后的病理表現，與SH-SY5Y細胞的AD模型相對比，以AD發病過程中經典炎癥通路NF-κB及其下游的相關蛋白為主線，探討HSV-1感染后與AD發病之間可能的聯系，為進一步研究提供參照。

1.材料與方法

1.1 材料與試劑

人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y購自美國細胞庫（ATCC），GIBCO胎牛血清、DMEM高糖培養液購自Invitrogen公司；Aβ1-42購自Sigma公司；RT-PCR試劑購自日本TAKARA公司；炎癥因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）引物購自上海生工公司，BDNF鼠單抗（15KD，ab205067）、NF-κB兔單抗（50KD/100KD，ab32360），Cox-2兔單抗（72KD，ab62331），TNF-α兔多抗（16KD，ab6671），iNOS兔多抗（131KD，ab15323），GAPDH鼠單抗（36KD，ab8245）購自abcam公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體購自上海碧云天公司（A019，A026）；細胞裂解液、BCA蛋白測定試劑盒購自北京普利萊技術有限公司；蛋白酶抑制劑購自Roche公司；PVDF膜購自Millipore公司；發光液購自上海碧云天生物技術公司。

1.2 病毒液準備

利用Vero細胞擴增HSV-1病毒并測定其滴度，將實驗室保存的HSV-1長期穩定感染的Vero細胞復蘇，待細胞融合至80%以上時收取細胞及培養上清液，-80℃冰箱反復凍融3次使細胞裂解，HSV-1病毒顆粒釋放，3000r/min離心15min，收集上清液，即為病毒液，保存于-80℃冰箱。通過空斑法定量（Plaque for ming unit ， PFU）法，確定其感染滴度為107 PFU。

1.3 細胞培養和病毒感染

SH-SY5Y細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養。待其單層細胞融匯80%時，用上述提取的HSV-1病毒液（ 107PFU）感染SH-SY5Y細胞，置培養箱中孵育2h，吸去病毒上清液液，再換含 2 %胎牛血清的維持液，置37 ℃、5 % CO2 孵箱繼續培養，作為HSV-1病毒感染組進行實驗，以病毒感染15h 后的細胞作為實驗組細胞；同時設立Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞模型組（Aβ1-42 15μM 誘導損傷15h）和未加處理的正常對照組SH-SY5Y細胞作為實驗分組。

1.4 RT-PCR檢測HSV-1糖蛋白D的表達

糖蛋白D（gD）是HSV-1感染組成性表達的基因，根據gD基因序列（登錄號：X14112）設計引物，上游引物：5'-GCAACTGTGCTATCCCCATCA-3'，下游引物：5'-CTCCGTCCAGTCGTTTATCTT-3'，擴增序列長度為221bp。從感染組和模型組以及正常組細胞中提取總RNA，以隨機引物逆轉錄成cDNA，并進行PCR擴增，檢測感染組的細胞中糖蛋白D的mRNA表達情況，以確定HSV-1感染是否建立。

1.5 RT-PCR檢測炎性因子的mRNA水平變化

分別提取正常組、模型組和HSV-1病毒感染組細胞的總RNA，使用TAKARA試劑盒，對炎癥因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）進行逆轉錄和PCR擴增后，判斷其mRNA水平的變化。

1.6 Western blot檢測炎癥因子的表達AD主要相關的炎癥因子包括BDNF、NF-κB，Cox-2，TNN-α，iNOS蛋白的檢測。分別提取HSV-1感染SH-SY5Y細胞15h后及模型組和正常組細胞的總蛋白，測定蛋白質濃度。蛋白樣品中加入5×緩沖液后，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進行電泳、轉膜、封閉；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體；加入化學發光試劑反應5min，將X射線底片放在聚偏二氟乙烯（Polyvinylicdene fluoride，PVDF）上曝光10min，沖洗顯影。

1.7 統計學處理

采用SPSS19.0統計軟件進行數據處理。組間差異顯著性采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2.實驗結果：

2.1 HSV-1感染SH-SY5Y細胞

病毒感染后12h，瓊脂糖凝膠電泳分析各組細胞的RT-PCR產物，病毒感染組細胞在221bp處可見特異性條帶（圖1），而其他兩組細胞為陰性結果。

2.2 RT-PCR法檢查炎性因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS） mRNA的變化，經PCR檢測發現，炎癥因子在病毒感染組和模型組呈現相一致的改變（圖2），差異具有統計學意義（p<0.05）。

2.3 炎癥通路相關蛋白檢測

經Western blot檢測發現，炎癥因子在病毒感染組和模型組呈現相一致的改變（圖3），差異具有統計學意義（p<0.05）。

3.討論

HSV-1也是中樞神經系統常見的病原體，有較強的嗜神經作用，導致神經元和膠質細胞的損傷，但是其確切的致病機制也尚未明確。

本次研究將Aβ1-42誘導的經典AD細胞模型與HSV-1感染的SH-SY5Y相對比發現，在炎癥因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）mRNA水平上和炎癥通路相關蛋白（BDNF、NF-κB、Cox-2、TNF-α、iNOS）的表達水平上都呈現相一致的變化差異。其中，炎癥因子（IL-2、IL-4、IL-10）作為免疫機制的重要因子，在病毒感染等外界的不良刺激下，會出現分泌異常的情況。BDNF在兩個實驗組中表達減弱，這可能是HSV-1和Aβ1-42干擾神經細胞微環境，進而影響到神經營養因子的分泌，導致神經細胞損傷，但是神經營養因子的表達和受體受到多重因素的調控，兩者是否具有相同的作用機制，還需進一步的研究。HSV-1的感染導致的炎癥反應，可能是機體或細胞的免疫防御反應，也可能是病毒擴散過程中對宿主的損傷[6]。

綜上所述，本研究通過體外實驗初步探究了HSV-1感染SH-SY5Y細胞與Aβ1-42誘導AD模型的病理變化，發現在對炎癥通路的干擾上，二者有著相似的表達差異，為后期研究提供了參考。但是HSV-1是不是導致AD的因素之一，尚需大量的研究論證，包括體外實驗和體內實驗。

參考文獻

[1]Marques C P ，Hu S ，Sheng W ，et al. Microg lial cellsinitiate vigo rous yet non -protective immune responsesduring HSV-1 brain infection [J].Virus Res，2006，121（1）：1 -10.

[2]畢丹蕾，文郎，熊偉，等. 阿爾茨海默病的可能藥物靶點和臨床治療研究進展[J]. 中國藥理學與毒理學雜志. 2015，8（4）： 507-536.

[3]SeIkOe DJ.AIzheimers disease is a synaptic failure[J].Science，2002. 298（5594）：789-791.

[4]Junq SS，Nalbantoglu J，Cashman NR. Alzheimers beta-amyloid precursor protein is expressed on the surface of immediately ex vivo braincell： a flow cytometric study [J]. J Neurosci Res，1996，46（3） ： 336-348.

[5]Sam G. The role of cerebral amyloid β accumulation in common forms of Alzheimer disease[J]. J Clin Invest，2005，115 （5） ：1121.

[6]侯云，李玲，胡明，等. HSV-1 感染對神經膠質瘤細胞NGF和BDNF表達變化的研究[J]. 病毒學報. 2010，26（6）： 477-482.