復(fù)方蛤青膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

吳 芳，楊燕子，樊寶娟，羅定強(qiáng)，戴 涌

（陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710061）

·檢驗檢測·

復(fù)方蛤青膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

吳 芳，楊燕子，樊寶娟，羅定強(qiáng)，戴 涌

（陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710061）

目的 建立復(fù)方蛤青膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜（TLC）法定性鑒別制劑中的紫菀、前胡和五味子；采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中黃芪甲苷和苦杏仁苷的含量。結(jié)果 建立的TLC法科學(xué)，專屬性強(qiáng)；黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.946～9.46μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，r＝0.999 5，平均回收率為101.12%，RSD為4.17%（n＝7）；苦杏仁苷進(jìn)樣量在0.370～5.813μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，r＝0.999 6，平均回收率為96.83%，RSD為3.08%（n＝8）。結(jié)論 建立的方法科學(xué)、簡便、專屬性較強(qiáng)，可有效控制復(fù)方蛤青膠囊的質(zhì)量。

復(fù)方蛤青膠囊；紫菀；前胡；五味子；黃芪甲苷；苦杏仁苷；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

復(fù)方蛤青膠囊由干蟾、黃芪、白果、紫菀、苦杏仁、前胡、附片、南五味子和黑胡椒組方，同系列片劑收載于2015年版《中國藥典（一部）》。復(fù)方蛤青系列制劑均有補(bǔ)氣斂肺、止咳平喘和溫化痰飲功效，臨床常用于治療肺虛咳嗽、氣喘痰多、老年慢性氣管炎、肺氣腫等。復(fù)方蛤青膠囊原標(biāo)準(zhǔn)中部分薄層色譜（TLC）鑒別項的專屬性不符合要求，含量測定項采用薄層掃描法測定黃芪甲苷的含量，專屬性和準(zhǔn)確性也有待提高。為此，本研究中考察了原有項目的專屬性和耐用性，刪除不適用項目，并根據(jù)處方、功效和工藝，增加新的檢驗項目，增加了TLC法定性鑒別方中的紫菀、前胡和五味子，采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中的黃芪甲苷和苦杏仁苷含量，以此建立復(fù)方蛤青膠囊可靠、有效的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Alliance型高效液相色譜儀，包括 2487／2695型雙波長紫外檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；BS224S型、BP211D型電子分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

紫菀對照藥材（批號120956－201106）、白花前胡甲素對照品（批號111711－200501）、黃芪甲苷對照品（批號 110781－200613）、苦杏仁苷對照品（批號110820－201004）、五味子對照藥材（批號 120922－201309）、前胡對照藥材（批號120951－201205）、五味子甲素對照品（批號110764－201312），均由中國食品藥品檢定研究院提供；復(fù)方蛤青膠囊樣品3批，其中2批為陜西東泰制藥有限公司提供（批號為5L02和5J03，國藥準(zhǔn)字Z20050525，規(guī)格為每粒0.45 g），1批為陜西興邦藥業(yè)有限公司提供（批號為 160701，國藥準(zhǔn)字Z20050565，規(guī)格為每粒0.3 g）；不含紫莞、前胡、五味子、黃芪、苦杏仁苷藥材的陰性樣品各1份（陜西東泰制藥有限公司提供）。硅膠（G）購自青島化工有限公司；流動相用甲醇、乙腈為色譜純（Avantor Performance Materials Sda Bhd）；水為高純水，其他試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 紫菀

分別取3批樣品內(nèi)容物研細(xì)，取約5 g，加甲醇40 mL，超聲處理 30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 m L，超聲5 min，濾過，將濾液經(jīng)過聚酰胺柱（80～100目，3 g，內(nèi)徑為1～1.5 cm，濕法裝柱），用水40 m L洗脫，收集流出液及洗脫液，用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，棄去乙酸乙酯液，水液再用水飽和的正丁醇提取2次，每次20mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇1m L使溶解，作為供試品溶液[1－2]。另取紫菀藥材0.5 g，加水100mL，煮沸30min，濾過，濾液經(jīng)過聚酰胺柱，同法制成對照藥材溶液。取不含紫菀藥材的的陰性樣品，與供試品溶液同法處理，作為陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典（四部）》通則0502]試驗，吸取各溶液5μL，分別點(diǎn)于同一薄層板上，以正丁醇－冰醋酸－水（7∶1∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖1。

圖1 紫菀薄層色譜圖

2.1.2 前胡

取3批樣品內(nèi)容物研細(xì)，取約5 g，加入乙醚15m L，浸泡靜置2 h后濾過，收集濾液并揮干，加入1mL乙酸乙酯使溶解，作為供試品溶液。另取前胡對照藥材約0.5 g，置三角瓶中，加入乙醚10m L，同法制得前胡對照藥材溶液[3－4]。再取白花前胡甲素對照品，加甲醇制成每1 mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。取不含前胡提取物的陰性樣品5 g，與供試品溶液同法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典（四部）》通則0502]試驗，吸取各溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯（3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在與對照藥材溶液色譜和對照品溶液色譜相應(yīng)位置上，供試品溶液色譜顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖2。

圖2 前胡薄層色譜圖

2.1.3 五味子

取3批樣品內(nèi)容物研細(xì)，取約5 g，加入三氯甲烷30mL，處理超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1m L使溶解，作為供試品溶液。另取五味子對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。再取五味子甲素對照品，加甲醇制成每1m L含1mg的溶液，作為對照品溶液。取不含五味子藥材的陰性樣品約5 g，與供試品溶液同法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典(四部)》通則0502]試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 GF254薄層板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上層液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。在與對照藥材溶液色譜和對照品溶液色譜相應(yīng)位置上，供試品溶液色譜顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖3。

2.2 黃芪甲苷[5－7]含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－水（32∶68）；奧泰2000S型蒸發(fā)光散射檢測器，氣化溫度95℃；流速：1.0 mL／min，柱溫：35℃。

圖3 五味子薄層色譜圖

2.2.2 溶液制備

取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.7mg的溶液，作為對照品溶液。

取樣品(批號為5J03)內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約10 g，精密稱定，精密加入甲醇100mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250W，頻率33 kHz）1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，精密吸取續(xù)濾液50mL，蒸干，殘渣加水15 mL使溶解，用水飽和的正丁醇提取4次，每次30m L，合并正丁醇提取液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次30 m L，合并堿液，用水飽和的正丁醇20 m L振搖提取，分取正丁醇提取液，與上述正丁醇液合并，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次40 mL（乳化時可放置過夜），每次洗滌液用同一水飽和的正丁醇20mL提取，合并正丁醇液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[8]1245。

稱取缺黃芪藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，色譜中未出現(xiàn)與對照品溶液色譜中黃芪甲苷保留時間相同的色譜峰，表明陰性無干擾，見圖4。

圖4 黃芪甲苷高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測圖

線性關(guān)系考察：稱取黃芪甲苷對照品（含量為95.8%）9.88mg，精密稱定，置20m L容量瓶中，加流動相至刻度，得質(zhì)量濃度為0.473 g／L的溶液。分別精密吸取該溶液2，4，5，8，10，15，20μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，測定。以對照品實際進(jìn)樣量（μg）的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、對應(yīng)峰面積積分值的對數(shù)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝1.53X＋5.66，r＝0.999 5（n＝7）。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.946～9.46μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液5μL，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果其積分值的 RSD為2.67%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：稱取樣品（批號為5J03）粉末適量，依法制備供試品溶液，分別于配制后0，5，10，15，20 h時進(jìn)樣，測定。結(jié)果峰面積的平均值為77 381.7，RSD為1.90%(n＝5)，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為5J03）適量，研細(xì)，共6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，測定。結(jié)果樣品含量的平均值為 1.232 mg／g，RSD為5.67%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：稱取樣品(批號為5J03)適量，研細(xì)，稱取5.0 g，精密稱定，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.936 4 g／L的黃芪甲苷對照品溶液各8mL，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣測定。結(jié)果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗結(jié)果

2.2.4 樣品含量測定

按擬訂方法進(jìn)樣測定，結(jié)果批號為160701，5L02，5J03的 3批樣品中黃芪甲苷的含量分別為 1.500，1.080，1.260mg／g。

2.3 苦杏仁苷含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇－0.05%醋酸溶液（20∶80），流速：1.0mL／min；檢測波長：210 nm。

2.3.2 溶液制備

稱取苦杏仁苷對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加入甲醇適量使溶解，定容，制成每1mL中約含0.2mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。

取樣品(批號為160701)內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足丟失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，作為供試品溶液[9－11]。

稱取缺苦杏仁的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：考察了2根不同品牌的色譜柱[Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）和資生堂MGⅡC18柱（250mm×4.6mm，5μm）]，分別設(shè)定流速為1.0mL／min和1.2mL／min，在不同色譜條件下測定同一供試品溶液的含量。結(jié)果的 RSD為2.30%，表明系統(tǒng)適用性良好。

專屬性試驗：取缺苦杏仁的陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，色譜中未出現(xiàn)與對照品溶液色譜中苦杏仁苷保留時間相同的色譜峰，陰性無干擾。見圖5。

圖5 苦杏仁苷高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：稱取苦杏仁苷對照品9.88mg，精密稱定，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，質(zhì)量濃度折純度93.6%后為0.185 0 g／L；再稱取苦杏仁苷對照品10.35 mg，精密稱定，置25 m L容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，質(zhì)量濃度折純度93.6%后為0.387 5 g／L。分別精密吸取質(zhì)量濃度為0.185 0 g／L的溶液2μL和10μL，質(zhì)量濃度為0.387 5 g／L的溶液5，10，20μL，注入液相色譜儀，進(jìn)樣量分別為0.370 0，0.775 0，0.925 0，1.850 0，1.937 5，3.100 0，3.875 0，5.813 0μg，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品實際進(jìn)樣量（μg，X）為橫坐標(biāo)、對應(yīng)峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝9.6×105X＋8.02×104，r＝0.999 6（n＝8）。結(jié)果表明，苦杏仁苷進(jìn)樣量在0.370～5.813μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10μL，按擬訂色譜條件操作，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果其積分值的 RSD為0.53%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：稱取樣品(批號為160701)粉末適量，依法制備供試品溶液，分別于配制后0，4，8，12，16 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果峰面積的平均值為2 236 046，RSD為3.01%(n＝5)，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：按擬訂方法，取樣品(批號為160701)粉末6份，進(jìn)樣，測定。結(jié)果樣品含量平均值為6.125mg／g，RSD為2.55%(n＝6)。

加樣回收試驗：稱取已知含量的樣品(批號為160701)內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約0.7 g，精密稱定，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.767 1 g／L的對照品溶液（精密稱取苦杏仁苷對照品16.39 mg，加甲醇溶劑并稀釋至20 mL，折純度93.6%后質(zhì)量濃度為0.767 1 g／L）各2m L（共加入1.534 2mg），依法制備供試品溶液并進(jìn)樣測定。結(jié)果見表2。

表2 苦杏仁苷加樣回收試驗結(jié)果

2.3.4 樣品含量測定

按擬訂方法進(jìn)樣測定，結(jié)果批號為160701，5L02，5J03的 3批樣品中苦杏仁苷的含量依次為 6.125，1.801，1.267mg／g。

3 討論

除文中所列薄層色譜外，還對處方中白果、苦杏仁藥材進(jìn)行了薄層色譜試驗，在多個色譜條件下，斑點(diǎn)均不明顯或?qū)傩圆环弦?，可能因工藝提取條件影響所致，需與生產(chǎn)企業(yè)合作進(jìn)行更進(jìn)一步的考察和研究。另外，因顯微鑒別項下鑒別了黃芪的顯微特征，含量測定項下也測定了黃芪甲苷的含量，出于節(jié)約檢驗檢測成本和時限考慮，黃芪甲苷的薄層色譜鑒別未列入標(biāo)準(zhǔn)。

復(fù)方蛤青膠囊有補(bǔ)氣斂肺、止咳平喘、溫化痰飲作用，方中黃芪有補(bǔ)氣升陽、利水消腫等功效[8]302，苦杏仁有降氣、止咳、平喘等功效[8]201，加之兩者含量在制劑中很大，故選擇黃芪甲苷和苦杏仁苷作為含量測定的指標(biāo)性成分，以合理控制制劑的質(zhì)量。黃芪甲苷的含量測定方法中，較常用的還有通過D101大孔吸附樹脂[8]302處理樣品。研究過程中考察了是否通過樹脂及超聲時間、用正丁醇溶液提取的次數(shù)對制劑含量的影響，結(jié)果不通過D101大孔吸附樹脂、超聲處理60 min及水飽和正丁醇提取4次時，黃芪甲苷的含量測定結(jié)果較高，重復(fù)性較好。

關(guān)于苦杏仁苷的流動相，考察了甲醇－水（20∶80）[12]、水－甲醇－乙腈（75∶20∶5）[13]和甲醇－0.05%醋酸溶液（20∶80），結(jié)果以甲醇－0.05%醋酸溶液（20∶80）為流動相時分離較好，苦杏仁苷色譜峰附近無干擾峰，故選擇列入標(biāo)準(zhǔn)。

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Quality Standard of Fufang Haqing Capsu le

Wu Fang，Yang Yanzi，F(xiàn)an Baojuan，Luo Dingqiang，Dai Yong
（Shaanxi Institute for Food and Drug Control，Xi′an，Shaanxi，China 710061）

Ob jective To establish the quality standard for Fufang Haqing Capsule.M ethods TLC method was used to identify Aster Tataricus，Radix Astragali，Peucedanum Praeruptorum，Schisandrae Chinensis Fructus.HPLC was used to determine the content of astragaloside and amygdalin.Resu lts The methods of TLC were scientific and strong specificity.The linear range of astragaloside was 0.946－9.46μg（r＝0.999 5）.The average recovery was 101.12% with the RSD of 4.17%(n＝7).The linear range of amygdalin was 0.370－5.813μg（r＝0.999 6）.The average recovery was 96.83% with the RSD of 3.08%(n＝8).Conclusion The method is scientific，simple and strong specificity，which can be used for quality control of Fufang Haqing Capsule.

Fufang Haqing Capsule；Aster Tataricus；Peucedanum Praeruptorum；Schisandrae Chinensis Fructus；astragaloside；amygdalin；quality standard

R286.0；R284.1

：A

：1006－4931(2017)12－0030－05

2017－03－15；

2017－04－05)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.12.008

吳芳，女，大學(xué)本科，副主任藥師，研究方向為中藥檢驗及質(zhì)量，（電話）029－62288444（電子信箱）8681070＠qq.com。