激素性股骨頭壞死中MMP2作用的研究

紀志華，賈丙申，于鵬，付昆，孟志斌，云大科

(海南醫學院第一附屬醫院關節創傷科1、脊柱骨病科2，海南海口570102)

激素性股骨頭壞死中MMP2作用的研究

紀志華1，賈丙申1，于鵬1，付昆1，孟志斌2，云大科1

(海南醫學院第一附屬醫院關節創傷科1、脊柱骨病科2，海南海口570102)

目的觀察家兔激素性股骨頭壞死股骨頭中基質金屬蛋白酶2(MMP2)的表達，探討MMP2在股骨頭壞死中的作用。方法將12只家兔按隨機數表法分為模型組和對照組，每組6只。模型組采用靜脈注射內毒素和肌肉注射甲基強的松龍的方法造模。對照組則應用等量的生理鹽水。10周后，檢測股骨頭的空骨陷窩率，髓腔脂肪面積和MMP2。結果模型組的空骨陷窩率、髓腔脂肪面積和MMP2分別為(20.26±9.83)%、(236.30±34.78)μm2和67.3%，均明顯高于對照組的(3.12±1.05)%、(178.80±21.82)μm2和21.1%，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論激素性股骨頭壞死中MMP2的高表達與其發生發展密切相關。

激素性股骨頭壞死；基質金屬蛋白酶；家兔

激素性股骨頭壞死(glucocorticoid-induced necrosis of femoral head，GNFH)是一種常見的骨壞死疾病[1]。基質金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMPs)屬于金屬蛋白酶家族，其在組織降解、修復等過程具有重要作用[2]。MMP2是MMPs中重要成員，其表達程度對骨組織的降解吸收具有重要作用，可能是骨壞死吸收的關鍵環節。

TIMP2和MMP2的對比變化在激素性股骨頭壞死中發生發展中具有重要作用。前期研究發現，TIMP2的低表達與股骨頭壞死發生密切相關。MMP2作為TIMP2的拮抗劑，其在股骨頭中的表達程度亦可能對激素性股骨頭壞死的發生產生影響。因此，我們檢測了MMP2在激素性股骨頭壞死中的表達程度，進而探究激素性股骨頭壞死中MMP2的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物家兔12只，雌雄各半，按照隨機數表法分為模型組和對照組，每組6只。家兔均由我單位動物試驗中心提供，平均體質量為(3.7±0.3)kg。

1.2 主要儀器與試劑MMP2試劑盒(武漢博士德公司)，顯微鏡(奧林巴斯)，甲強龍注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(比利時輝瑞公司)，內毒素(Sigma)。

1.3 造模方法按照紀志華等[3]研究的方法造模。具體為6只家兔均經耳緣靜脈注射l0μg/(mL·kg)的內毒素(LPS)一次；次日，再臀部肌肉注射40 mg/kg甲基強的松龍，并同時給予臀部肌肉注射青霉素鈉40萬U，預防感染。連續用藥3 d。對照組則注射等劑量的生理鹽水。

1.4 指標測定10周后，以40 mg/kg的3%戊巴比妥過量腹腔注射法處死家兔，無菌操作狀態下取出股骨頭，剔除多余軟組織，縱行鋸開股骨頭，經過固定、脫鈣等HE染色程序處理后，在顯微鏡下觀察后計算：①髓腔中脂肪面積：觀察50個視野，經過圖像采集，圖像分析儀定量分析測定髓腔脂肪面積。②空骨陷窩率：高倍鏡下隨機選擇20個視野，每個視野計數50個骨陷窩及總的空骨陷窩，空骨陷窩率=空骨陷窩數/50×100%。

1.5 免疫組化檢測將股骨頭組織脫鈣后切片并浸入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，微波爐加熱15 min，冷卻后0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，滴加第二抗體及血清封閉液，室溫20℃，滴加稀釋第一抗體，4℃冰箱保存過夜，滴加SABC試劑，DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 動物一般情況模型組逐漸出現食量減少、精神差、體質量降低，無死亡。模型組HE染色可觀察到骨小梁出現稀疏、斷裂和空骨陷窩發生，見圖1。而對照組骨小梁形態正常。顯微鏡下觀察模型組MMP2表達明顯高于對照組，見圖2。

圖1HE染色(×100)

圖2MMP2表達(×200)

2.2 空骨陷窩率及髓腔脂肪面積情況對照組和模型組的空骨陷窩率分別為(3.12±1.05)%和(20.26± 9.83)%；而髓腔脂肪面積分別為(178.80±21.82)μm2和(236.30±34.78)μm2，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 MMP2表達情況經過免疫組化方法，檢測兩組的MMP2陽性表達并轉化成百分比，模型組為67.3%，對照組為21.1%，差異有統計學意義(χ2=5.353，P=0.020＜0.05)。

3 討論

基質金屬蛋白酶家族(MMPs)是細胞外基質降解重要的一類蛋白水解酶。MMPs也是骨組織細胞外的一種蛋白水解必需酶，主要降解骨細胞外基質。MMPs基于分子結構和底物的異同分為明膠酶、膠原酶、基質溶解素等。MMP2作為基質金屬蛋白酶家族中重要的一種酶，屬于明膠酶范疇，可以降解各型膠原蛋白、多糖和粘連蛋白等[3]。MMP2直接參與降解骨細胞外基質。MMP2在骨壞死細胞外基質降解過程中，具有獨特而重要的作用。具體表現在當MMP2高表達時，Ⅰ型膠原屏障被其降解，從而激活破骨細胞，啟動破骨細胞介導的骨吸收過程[4-5]，其活性越高，骨吸收過程越強烈，從而導致骨壞死等骨病的發生。

前期研究中證實，兔激素性股骨頭壞死后，股骨頭內出現空骨陷窩，髓腔中脂肪細胞明顯增多[6]，微觀上符合激素性股骨壞死病理學診斷標準。經過免疫組化檢測，模型組的MMP2表達明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。家兔激素性股骨頭壞死中MMP2出現異常的高表達，與空骨陷窩率和髓腔脂肪面積具有明顯的相關性。

本研究表明激素性股骨頭壞死的發生與MMP2的高表達有密切關系。MMP2可能通過降解骨基質內特定的底物，激活了破骨細胞，從而誘導了異常增多的股骨頭內骨吸收發生，出現了激素性股骨頭壞死。需要指出的是，本實驗研究經費有限，樣本量小，可能存在一定的誤差，在今后的研究中需要更加深入研究。

[1]Zhao Z,Xue Y.Polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene and associations with glucocorticoid-induced avascular osteonecrosis of the femoral head[J].Genet Test Mol Biomarkers,2017,27(10)：1089.

[2]Deng X,He G,Levine A,et al.Adenovirus-mediated expression of Timp-1 and TIMP-2 in bone inhibits osteolytic degradation by human prostate cancer[J].Int J Cancer,2008,122(1)：209-218.

[3]Sousa LH,Linhares EV,Alexandre JT.Effects of atorvastatin on periodontitis of rats subjected to glucocorticoid-Induced osteoporosis[J]. J Periodontol,2016,87(10)：1206-1216.

[4]Bian Y,Qian W,Li H,et al.Pathogenesis of glucocorticoid-induced avascular necrosis：A microarray analysis of gene expression in vitro [J].Int J Mol Med,2015,36(3)：678-684.

[5]Pan B,Farrugia AN.The nitrogen-containing bisphosphonate zoledronic acid influences RANKL expression in human osteoblast-like ceHs by activating TNF-alpha conveing enzyme(TACE)[J].J Bone Miner Res,2004,19(1)：147.

[6]紀志華,賈丙申,于鵬,等.TIMP2在激素性股骨頭壞死中的作用的實驗研究[J].海南醫學,2016,27(18)：2925-2926.

Role of MMP2 in glucocorticoid-induced necrosis of the femoral head.

JI Zhi-hua1,JIA Bing-shen1,YU Peng1,FU Kun1,MENG Zhi-bin2,YUN Da-ke1.Department of Joint Injury1,Department of Spine Bone Disease2,Haikou 570102, Hainan,CHINA

ObjectiveTo explore the mechanism of matrix metalloproteinase2(MMP2)in glucocorticoid-induced necrosis of the femoral head by observing the expression of MMP2 in rabbits.MethodsA total of 12 rabbits were randomly divided into the model group and the control group.The model group was modeled by intravenous injection of endotoxin and intramuscular injection of methylprednisolone.And the control group was injected with equal volume of saline solution.After 10 weeeks,the rate of empty lacuna rate in the femoral head,the area of fat in the medullary cavity and the expression of MMP2 were measured.ResultsThe rate of empty lacuna rate in the femoral head,the area of fat in the medullary cavity and the expression of MMP2 were(20.26±9.83)%,(236.30±34.78)μm2and 67.3%in the model group,which were significantly higher than(3.12±1.05)%,(178.80±21.82)μm2and 21.1%in the control group(P＜0.05).ConclusionThe high expression of MMP2 is closely related to the occurrence of glucocorticoid-induced necrosis of the femoral head.

Glucocorticoid-induced necrosis of the femoral head;Matrix metalloproteinase(MMP);Rabbit

R-332

A

1003—6350（2017）14—2245—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.14.003

2017-04-13)

海南省自然科學基金(編號：814357)

賈丙申。E-mail：jbs123@163.com