基于一測多評法測定甘肅紅芪中4種黃酮類成分

楊秀娟 邵晶 楊志軍 吳國霞 寧艷梅 張金保 黑生瑞

摘要：目的 建立甘肅紅芪中芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素4種黃酮類成分的一測多評法，驗證該方法在紅芪質量評價中應用的準確性及可行性。方法 以毛蕊異黃酮為內標，分別建立毛蕊異黃酮與芒柄花苷、金雀異黃酮、芒柄花素的相對校正因子，計算紅芪中毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的含量，實現一測多評。結果 各相對校正因子重復性良好，一測多評法測定結果與外標法無顯著差異。結論 以毛蕊異黃酮為內標，同時測定芒柄花苷、金雀異黃酮、芒柄花素的一測多評法可用于紅芪的定量分析。

關鍵詞：一測多評；紅芪；芒柄花苷；毛蕊異黃酮；金雀異黃酮；芒柄花素；相對校正因子

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.015

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）08-0066-04

Content Determination of Four Flavonoids in Hedysari Radix in Gansu Province Based on Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker YANG Xiu-juan1，2， SHAO Jing1，2， YANG Zhi-jun1，2， WU Guo-xia1， NING Yan-mei1，2， ZHANG Jin-bao1，2， HEI Sheng-rui1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese and Tibetan Medicine of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To establish a method for simultaneous determination for the contents of four flavones （ononin， calycosin， genistein and formononetin） of Hedysari Radix in Gansu Province with quantitative analysis of multi-components by single-marker （QAMS）； To prove its feasibility and accuracy. Methods Calycosin was taken as internal standard substance. Relative correction factors （RCF） of ononin， genistein and formononetin to calycosin were established. The contents of ononin， calycosin， genistein and formononetin were determined to realize QAMS. Results RCF was with good repeatability. The results of QAMS were consistent with the results of the external standard method. Conclusion The method that determines the contents of ononin， genistein and formononetin with calycosin as internal standard substance， can be used for quantitative analysis of Hedysari Radix.

Key words： quantitative analysis of multi-components by single marker； Hedysari Radix； ononin； calycosin； genistein； formononetin； relative correction factor

紅芪是豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand. Mazz.的干燥根[1]，其性微溫、味甘，歸肺、脾經，具有補氣升陽、利水消腫、生津養血等功效。紅芪根皮為紅棕色，因此而得名，最早記載于《神農本草經》，南北朝時期梁代陶弘景在《本草經

基金項目：甘肅省財政廳高等學校基本科研業務費項目（BH-2013-20）；甘肅省高等學校基本科研基金資助項目（BH2012-020）；甘肅省高等學校科研項目（2016B-054）；甘肅中醫藥大學中青年科研基金項目（2305016601）

通訊作者：楊志軍，E-mail：yangzhijun1971@yeah.net

集注》中描述：“有赤色者，可作膏貼，俗方多用，道家不須。”紅芪現主要分布在甘肅隴南、天水、定西等地區，一般被認為是甘肅的道地藥材，為十大隴藥之一[2]。目前，較多學者就紅芪化學成分及其藥理活性展開了大量研究，發現紅芪中含有較多的活性物質如黃酮[3]、皂苷[4]、生物堿、氨基酸、有機酸、甾醇、多糖[5]、微量元素[6]等，且藥理作用廣泛，主要包括提高免疫能力、強心利尿、抗自由基、抗病毒等[7]。

一測多評法是利用中藥有效成分之間的內在函數和比例關系測定1個成分而實現多個成分的同步測定，該方法已在枳實、大黃、淫羊藿等藥材的含量測定中得到應用[8-11]，2015年版《中華人民共和國藥典》收載了黃連等藥材的一測多評法含量測定。本研究采用一測多評法測定紅芪中4種黃酮類成分，為紅芪藥材多指標定量測定提供全新的分析模式。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀（DAD檢測器，四元泵），Hanbon Sci. &Tech.Phecda; C18色譜柱（5 ?m，4.6 mm×250 mm），電子天平（AL104，梅特勒-托利多儀器上海有限公司），恒溫水浴鍋（HH-S，金壇市大地自動化儀器廠），超聲清洗儀（KQ-250，昆山市超聲儀器有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（SFG-02B，黃石市恒豐醫療器械有限公司）。

芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素對照品（批號分別為PY150816RM、PY150826RM、PY150814RC、PY150822YG，南京普怡生物科技有限公司，純度均為99%），乙腈為色譜純，甲醇、磷酸等其他試劑均為分析純。

11批紅芪樣品分別采自甘肅武都、隴西、甘谷、武山等10個產地，經甘肅中醫藥大學藥學院李成義教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand. Mazz.的干燥根，樣品來源見表1。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素對照品適量，加甲醇分別制成0.481 3、0.492 0、0.130 5、0.452 6 mg/mL的對照品溶液。取上述溶液適量于同一量瓶中，制得混合溶液，即濃度分別為0.048 13、0.049 20、0.003 95、0.045 26 mg/mL的對照品貯備液A。精密量取對照品貯備液A 1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液B。

2.2 供試品溶液制備

取紅芪樣品粉末（過2號篩）約3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：Hanbon Sci. &Tech.Phecda; C18（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，10%～15%B；10～15 min，15%～25%B；15～35 min，25%～45%B；35～45 min，45%～60%B）；柱溫：25 ℃；波長：254 nm；進樣量：10 ?L；流速：1 mL/min。記錄45 min色譜圖，供試品和對照品分離情況良好，見圖1。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 取上述對照品貯備液A、B，分別進樣2.5、5、10、15、20 ?L，分析記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得到各對照品的回歸方程和線性范圍（見表2）。結果表明，芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素4種成分在各自的范圍內呈良好線性關系。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，連續進樣6次，計算芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的峰面積RSD分別為2.14%、1.46%、2.34%、1.70%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取同一紅芪樣品（GS-2）粉末6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件分別進樣測定。結果芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的含量分別為0.108 9、0.025 5、0.003 6、0.117 0 mg/g，各成分含量RSD分別為3.77%、0.82%、2.56%、0.96%，表明本方法重復性較好。

2.4.4 穩定性試驗 精密吸取同一紅芪（GS-2）供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.3”項下色譜條件進樣10 ?L，測得芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的峰面積RSD分別為3.44%、0.93%、2.17%、1.34%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已測定的樣品6份，每份1.5 g，分別加入一定量對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件分別進樣測定，結果芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的平均加樣回收率分別為98.81%、102.54%、101.87%、98.28%，RSD分別為2.08%、1.84%、2.38%、2.32%，表明本方法準確度良好。

2.5 相對校正因子的測定

2.5.1 待測成分相對校正因子的計算 取混合對照品溶液，按“2.3”項下條件進行測定，分別進樣1、2.5、5、10、15 ?L，以毛蕊異黃酮為內標，分別計算芒柄花苷、金雀異黃酮、芒柄花素的相對校正因子（fR）。計算公式：fR=fs/i=（As×Ci）/（Ai×Cs），式中As為內標峰面積，Cs為內標濃度，Ai為待測成分對照品峰面積，Ci為待測成分對照品濃度。結果見表3。

2.5.2 相對校正因子重現性考察 分別采用Hanbon Sci. &Tech.Phecda; C18和Angilent XDB色譜柱，分別考察了Angilent 1260和Angilent 1200液相色譜系統對校正因子的影響，結果各成分相對校正因子的重現性良好（RSD<5%），見表4。

2.5.3 相對校正因子的確定 根據《一測多評法建立的技術指南》[12]，綜合影響校正因子的因素，取各次試驗結果平均值，最終確定芒柄花苷、金雀異黃酮、芒柄花素的相對校正因子分別為1.15、0.72、0.75。

2.5.4 待測成分色譜峰的定位 計算在不同色譜儀器或不同色譜柱中各待測成分色譜峰與毛蕊異黃酮色譜峰的相對保留時間（rk/s）。rk/s=TR（k）/TR（s），式中k為待測組分，s為對照物。利用相對保留時間定性，對各待測成分進行定位。結果表明相對保留時間的波動較小，其RSD均小于5%，見表5。

2.6 一測多評法與外標法測定結果的比較

分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 ?L，注入高效液相色譜儀，依法測定11批樣品，采用外標法和一測多評法計算紅芪中芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素含量，結果見表6。并對一測多評法與外標法得到的量值進行比較，2種方法所得值的偏差均在5%以內，由此說明一測多評法用于紅芪藥材及其炮制品的多成分質量評價研究是可行的。

3 討論

毛蕊異黃酮對照品在市場上可購得，且試驗發現，以毛蕊異黃酮為內標，在不同色譜柱和不同色譜儀上保留時間差值波動最小，均在5%以內。而若以芒柄花苷為內標，則保留時間差值的波動均大于5%，不宜進行待測組分色譜峰的定位。故最終確定以毛蕊異黃酮為內標，建立紅芪中4種黃酮類成分的一測多評方法。

在色譜條件的考察過程中，我們對檢測波長、流動相組成、樣品提取方式、提取溶劑及提取時間均做了考察。經HPLC-DAD檢測器全波長掃描，綜合考慮，優選出芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的檢測波長為254 nm；通過考察甲醇及乙醇2種溶媒及提取時間30 min、1 h、2 h，優化出最佳提取條件為紅芪用甲醇回流提取1 h。

紅芪主產于甘肅武都、宕昌、甘谷、武山、隴西等地。本試驗采集了甘肅10個產地11批紅芪藥材，用校正因子法從一測多評的角度闡明了主要成分間的相互關系，實現在對照品短缺的情況下進行多指標成分含量測定。結果表明，一測多評法與外標法實測值間沒有顯著差異，說明建立的校正因子具有較好的可信度。采用一測多評法對紅芪進行更全面的質量控制可為深入開發利用紅芪資源提供科學依據。

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（收稿日期：2016-10-20）

（修回日期：2016-11-05；編輯：陳靜）