雙水相萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮及其抗氧化活性

肖星輝，張向前，李桂芳，李予霞

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子832003）

雙水相萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮及其抗氧化活性

肖星輝，張向前，李桂芳，李予霞*

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子832003）

采用乙醇-鹽雙水相萃取法研究荒漠肉蓯蓉總黃酮的萃取工藝及其體外抗氧化性。采用正交試驗(yàn)法對(duì)荒漠肉蓯蓉總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化；通過(guò)對(duì)羥基自由基和DPPH·的清除率對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。荒漠肉蓯蓉總黃酮最佳提取工藝條件：料液比為1∶50（g/mL），提取溶劑為50%的乙醇溶液，提取時(shí)間為3.5 h，提取溫度為90℃，此條件下肉蓯蓉中總黃酮平均得率可達(dá)到（13.04±0.06）%；最佳雙水相分離體系為EtOH-K2HPO4，分離條件為70% EtOH、0.2 g/mL K2HPO4、荒漠肉蓯蓉提取液體積分?jǐn)?shù)14%；雙水相萃取工藝對(duì)荒漠肉蓯蓉總黃酮的富集倍數(shù)為2.85；荒漠肉蓯蓉總黃酮對(duì)DPPH·和·OH的最高清除率分別91.8%和35.9%，表明荒漠肉蓯蓉總黃酮對(duì)DPPH·的清除效果強(qiáng)于·OH，具有較好的抗氧化活性。

荒漠肉蓯蓉；黃酮；正交試驗(yàn)；EtOH-K2HPO4體系；抗氧化活性

肉蓯蓉（cistanche）為列當(dāng)科（Orobanchaceae）多年生草本植物，多生于藜科（Chenopodiaceae）梭梭屬（Haloxylon）植物梭梭（鹽木）（Haloxylon ammodendron）和白梭梭（Haloxylon persicum）的根部，具有很強(qiáng)的抗旱、抗寒、耐鹽堿特性。新疆荒漠肉蓯蓉素有沙漠人參的美譽(yù)[1]。隨著生物衰老學(xué)說(shuō)及自由基生命科學(xué)的發(fā)展，黃酮也因其具有強(qiáng)的抗氧化性和強(qiáng)的清除自由基的能力而受到廣泛的重視，是一種在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣泛開發(fā)前景的天然抗氧化劑，許多富含黃酮類化合物的植物、中草藥資源被開發(fā)利用出來(lái)[2-4]。前期研究表明，肉蓯蓉具有抗衰老、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功能。為綜合開發(fā)利用肉蓯蓉資源，對(duì)新疆荒漠肉蓯蓉中總黃酮提取工藝、純化及體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步提取純化新疆荒漠肉蓯蓉黃酮做出參考，也為進(jìn)一步探討其藥理活性、資源保護(hù)和中藥制劑等綜合利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與原料

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國(guó)sigma公司；蘆丁（批號(hào)：100080-200707）：中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院；L-（+）-抗壞血酸（VC）、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

荒漠肉蓯蓉：新疆古爾班通古特沙漠各沙區(qū)。

1.2 儀器

UV-2700紫外分光光度計(jì)：島津儀器有限公司；真空干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠；SHB-A（Ⅲ）循環(huán)式真空泵：天津天有利科技有限公司；ANKEGL-20G-2型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；電子天平：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；恒溫水浴鍋：上海博訊公司；N-1100S-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：深圳賽普儀科技有限公司；Thermo fisher離心機(jī)：賽默飛世爾科技公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 荒漠肉蓯蓉總黃酮的測(cè)定[5]

樣品荒漠肉蓯蓉中黃酮得率測(cè)定：準(zhǔn)確移取1.0mL的樣品液于比色管中測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：Y=0.1091X-0.0091，計(jì)算黃酮質(zhì)量。總黃酮得率按如下公式計(jì)算：

黃酮得率/%=CV/M×100

式中：C為提取液濃度，g/mL；V為提取液原始體積，mL；M為所取荒漠肉蓯蓉粉末質(zhì)量，g。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化總黃酮提取工藝條件

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素選取3個(gè)對(duì)總黃酮得率影響較大的水平，建立L9（34）試驗(yàn)組合，以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)各因素的3個(gè)水平進(jìn)行編碼（見表1），優(yōu)化古爾班通古特沙漠中荒漠肉蓯蓉總黃酮的提取工藝。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2.3 乙醇-無(wú)機(jī)鹽雙水相體系分離純化總黃酮

采用濁度法[6]，繪制無(wú)機(jī)鹽（Na2CO3、K2CO3、草酸鈉、（NH4）2SO4、K2HPO45種鹽作為試驗(yàn)用無(wú)機(jī)鹽）雙水相體系相圖。

荒漠肉蓯蓉總黃酮的萃取與純化：將提取的肉蓯蓉粗黃酮配置成一定濃度的黃酮溶液（黃酮含量0.15 g）加入到已知無(wú)機(jī)鹽/乙醇的雙水相體系中，充分振蕩，靜置1 h左右，記錄上下相的體積，分別測(cè)出上下相的黃酮濃度，進(jìn)而計(jì)算出相比R，分配系數(shù)K，萃取率Y。計(jì)算公式：

式中：Va是上相體積，mL；Vb是下相體積，mL。

式中：Ca是上相黃酮濃度，mg/mL；Cb是下相黃酮濃度，mg/mL。

式中：Y為萃取率，%；K為分配系數(shù)；R為相比。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)及總黃酮純化倍數(shù)的測(cè)定

稱取荒漠肉蓯蓉粗提物2.00 g，按最佳工藝條件進(jìn)行雙水相萃取，讀取上、下相體積，分析上、下相中肉蓯蓉總黃酮的量，計(jì)算R、K和Y。取乙醇相（上相）揮干溶劑，得黃酮浸膏。分別精密稱取3份醇提浸膏，配置成一定質(zhì)量濃度的供試液，測(cè)定黃酮，計(jì)算萃取后黃酮的純化倍數(shù)。

2.5 抗氧化性試驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)確定的荒漠肉蓯蓉總黃酮提取最佳條件進(jìn)行提取，提取液離心（4 000 r/min）10 min，取上清液，經(jīng)雙水相分離純化液回收乙醇溶劑后濃縮干燥即得荒漠肉蓯蓉總黃酮粗提物。配制適宜質(zhì)量濃度溶液進(jìn)行抗氧化活性試驗(yàn)。DPPH·清除率的測(cè)定和羥自由基清除率的測(cè)定參照文獻(xiàn)[7-9]。計(jì)算公式如下：

式中：A1為溶劑與樣液混合液的吸光度；A2為樣液與DPPH·反應(yīng)后的吸光度；A3為溶劑與DPPH混合液的吸光度。

式中：Ax為樣品組吸光度；A1為對(duì)照組吸光度；A0為空白組吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 正交試驗(yàn)法提取荒漠肉蓯蓉總黃酮最佳工藝結(jié)果分析

稱取干燥的荒漠肉蓯蓉粉末2.0 g于錐形瓶中，按正交表安排（表1）進(jìn)行試驗(yàn)，提取液過(guò)濾，減壓濃縮至20 mL，濃縮液用30%的乙醇定容至50 mL，即為總黃酮提取液。從中取1 mL樣品按照2.1中的測(cè)定方法對(duì)其進(jìn)行處理和測(cè)量，結(jié)果分析見表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 2 The experimental results of orthogonal test

表3 顯著性檢驗(yàn)（方差分析）Table 3 Significance test（ANOVA）

從各因素的顯著性水平差異看出，荒漠肉蓯蓉總黃酮得率的影響次序是：提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇濃度＞料液比，且對(duì)總黃酮得率的影響都達(dá)到了極顯著水平（P＜0.001）；通過(guò)各因素間的交互作用及其對(duì)多糖得率影響的相關(guān)性分析得知：溫度與時(shí)間對(duì)總黃酮的得率有非常顯著的影響，提取溫度與時(shí)間也具有一定的相關(guān)性（P＜0.001）；乙醇濃度與提取時(shí)間的相關(guān)性（P＜0.05）小于上述兩種組合的交互作用，這一結(jié)論與方差分析一致。從而說(shuō)明：影響荒漠肉蓯蓉提取的決定因素為提取溫度和回流的時(shí)間。最佳提取工藝為A3B3C2D3，即提取溫度為90℃，料液比為1∶50（g/mL），乙醇濃度為50%，回流時(shí)間為3.5 h。經(jīng)驗(yàn)證，該條件下荒漠肉蓯蓉總黃酮得率為（13.04±0.06）%，均高于單因素提取所獲總黃酮得率。

3.2 雙水相總黃酮提純工藝的確立

3.2.1 5種鹽相圖的繪制和分相能力的考察

室溫下構(gòu)建了5種鹽—雙水相體系（EtOH與Na2CO3、K2CO3、NaOOCCOONa、（NH4）2SO4、K2HPO4的雙水相體系），并繪制了5種鹽與無(wú)水乙醇形成的雙水相相圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1 5種鹽—乙醇形成的雙水相體系圖Fig.1 Aqueous two-phase system of five kinds of salt ethanol

由圖1可知，5種鹽—乙醇皆可以形成雙水相體系，通過(guò)各綜合因素分析：K2HPO4分相能力強(qiáng)，且分相范圍大、穩(wěn)定，分配系數(shù)也大，黃酮幾乎都分布于上相。在此基礎(chǔ)上篩選最佳EtOH/K2HPO4雙水相體系。

3.2.2 最佳提取黃酮的EtOH/K2HPO4雙水相體系的確立

雙水相萃取是一種新型的黃酮類化合物的分離純化方法。在雙水相中，當(dāng)H2O與EtOH體積比一定時(shí)，鹽越多，下相的體積越大，鹽的量達(dá)到一定時(shí)會(huì)析出晶體；而當(dāng)鹽和EtOH的質(zhì)量一定時(shí)，水過(guò)多就形不成雙水相體系，水過(guò)少易析出晶體[10]，所以需要確定適當(dāng)H2O、鹽與EtOH的體積比，結(jié)果見圖2。

圖2 不同雙水相體系對(duì)黃酮萃取率的影響Fig.2 Effect of different aqueous two phase systems on the extraction rate of total flavonoids

由圖2（A）可知，當(dāng)φ乙醇=80%時(shí)，隨著K2HPO4量的加入，相比隨之降低，下相的體積增大，萃取率也略呈下降趨勢(shì)。K2HPO4的加入量為5 g時(shí)，萃取率達(dá)到最大，但分配系數(shù)不穩(wěn)定。由圖2（B）可知，當(dāng)φ乙醇=70%時(shí)，隨著K2HPO4的增加，分配系數(shù)增大，相比下降，對(duì)萃取率的影響也不是太大，K2HPO4的加入量為10 g時(shí)，萃取率達(dá)到最大為99.07%。由圖2（C）可知，K2HPO4的加入量對(duì)黃酮萃取率的影響較大，且隨鹽量的增加總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由圖2（D）可知，在φ乙醇=50%時(shí)，隨著K2HPO4質(zhì)量的增加，黃酮萃取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且影響相對(duì)較大。總體分析，各體系（乙醇和水的體積比一定的情況下）相比是隨著鹽濃度的增加而逐漸變小，即鹽的增加會(huì)導(dǎo)致下相的體積增大，相比減小[10]。故以黃酮的萃取率及提純工藝為目標(biāo)對(duì)各因素進(jìn)行綜合分析后，擬確定提取荒漠肉蓯蓉總黃酮的最佳雙水相萃取體系為：φ乙醇=70%，K2HPO4量為10.0 g，在此體系中，分配系數(shù)為24.66，相比為4.33，萃取率達(dá)99.07%。

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)及純化倍數(shù)結(jié)果

精密稱取3份荒漠肉蓯蓉粗提品（用10 mL水溶解，含黃酮0.15 g），按試驗(yàn)獲得的最佳萃取工藝條件即φ乙醇=70%，ρ（K2HPO4）=0.2 g/mL，在此雙水相體系中萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮，測(cè)定上、下相中黃酮含量，計(jì)算R、K和Y，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of validation test

試驗(yàn)結(jié)果表明在最佳萃取工藝條件下，兩相中總黃酮的分配系數(shù)平均值為24.62（n=3，RSD=0.66%），乙醇相中黃酮的最大萃取率可達(dá)99.08%（n=3，RSD= 0.18%）。

按照最佳工藝條件萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮，測(cè)定雙水相萃取前后粗品中總黃酮的量，試驗(yàn)結(jié)果顯示萃取前后粗品中總黃酮的含有量分別為（13.04±0.06）%（n=3，RSD=1.23%）和（37.16±0.31）%（n=3，RSD=1.31%），萃取后粗品中總黃酮的含有量是萃取前的2.85倍。

3.4 荒漠肉蓯蓉黃酮的抗氧化活性

荒漠肉蓯蓉總黃酮粗提物對(duì)自由基的清除試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 荒漠肉蓯蓉總黃酮對(duì)自由基的清除效果Fig.3 The clearance ability of total flavonoids of Cistanche deserticola Y.C.Ma to DPPH·and hydroxyl free radical

試驗(yàn)結(jié)果表明，在0～5.2 mg/mL范圍內(nèi)，荒漠肉蓯蓉黃酮對(duì)DPPH自由基和·OH具有極好的清除能力，隨著肉蓯蓉黃酮質(zhì)量濃度的增加，清除作用增強(qiáng)，具有一定的量效關(guān)系，但均低于VC的抑制效果，這一結(jié)果與歐陽(yáng)杰[11]結(jié)果一致。從圖中可以看出，荒漠肉蓯蓉總黃酮對(duì)于清除DPPH自由基的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于·OH基的能力，表明荒漠肉蓯蓉總黃酮對(duì)不同自由基的清除能力不同。荒漠肉蓯蓉總黃酮質(zhì)量濃度大于2.56 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加對(duì)DPPH自由基清除能力影響逐漸減弱不大，此時(shí)的清除率為73.32%，清除率最高可達(dá)91.8%；對(duì)·OH的清除能力最大可35.9%，此時(shí)荒漠肉蓯蓉黃酮的質(zhì)量濃度為5.12 mg/mL。

4 討論

本研究根據(jù)傳統(tǒng)中藥藥劑的制備方法，利用回流法提取荒漠肉蓯蓉黃酮類有效成分，并進(jìn)行純化及抗氧化活性測(cè)定，旨在為今后研發(fā)肉蓯蓉制劑的質(zhì)量和療效奠定基礎(chǔ)[12]。試驗(yàn)結(jié)果如下：

1）采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化了回流提取新疆荒漠肉蓯蓉總黃酮的工藝，最佳提取工藝條件為提取溫度為90℃，料液比為1∶50（g/mL），乙醇濃度為50%，回流時(shí)間為3.5 h。在此條件下，荒漠肉蓯蓉總黃酮得率為（13.04±0.06）%，均高于單因素提取所獲總黃酮得率。影響荒漠肉蓯蓉總黃酮得率大小的因素主次順序?yàn)椋禾崛囟龋咎崛r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比，其中提取時(shí)間與提取溫度因素之間的交互作用顯著，對(duì)荒漠肉蓯蓉總黃酮得率影響較大。

2）試驗(yàn)結(jié)果表明利用乙醇—鹽雙水相體系萃取純化荒漠肉蓯蓉中的總黃酮是可行的。乙醇-K2HPO4雙水相體系萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮的最佳工藝條件為：φEtOH=70%，ρ（K2HPO4）=0.2 g/mL。粗提物加入量為0.15 g，混合后形成雙水相，相比為4.31，分配系數(shù)為24.62，上相中最大萃取率達(dá)99.08%。雙水相萃取后荒漠肉蓯蓉總黃酮純度提高了2.85倍，純度達(dá)37.16%。說(shuō)明EtOH/K2HPO4雙水相萃取體系分離純化荒漠肉蓯蓉具有一定的選擇性。

3）荒漠肉蓯蓉總黃酮可以有效清除DPPH自由基和·OH，且量效關(guān)系顯著，其清除DPPH自由基的能力高于·OH；對(duì)DPPH自由基清除率最高可達(dá)91.8%，·OH的清除率只有35.9%。

黃酮類化合物的分離提純對(duì)醫(yī)藥及食品工業(yè)是十分重要的，組成雙水相的一些無(wú)機(jī)鹽對(duì)生物活性物質(zhì)無(wú)傷害，因此不會(huì)引起生物物質(zhì)失活或變性。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然黃酮的萃取率高，但其純度不高，原因是雙水相不具有特異性和專一性[12]，在肉蓯蓉中含有其他的一些易溶于乙醇的物質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相，而導(dǎo)致黃酮的純度降低，所以對(duì)于提高黃酮的純度還需要進(jìn)一步探究。

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Aqueous Two-phase Extraction of Total Flavonoids from Cistanche deserticola Y.C.Ma and the Antioxidant Activity of the Extracts

XIAO Xing-hui，ZHANG Xiang-qian，LI Gui-fang，LI Yu-xia*
（College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832003，Xinjiang，China）

Aqueous two-phase extraction was applied to extract the total flavonoids in Cistanche deserticola Y. C.Ma and the antioxidant ability of the extracts in vitro was also investigated．Orthogonal tests were employed to optimize the extraction technology．The antioxidant ability of the extraction solution was evaluated according to its scavenging activity and reducing power for DPPH·and·OH．The optimal feed liquid ratio，the ratio between ethanolandwater,extractiontimeandextractiontemperaturewere1∶50（g∶mL）,50%ethanolsolution,3.5hours and and extraction temperature 90℃,respectively.The concentration of total flavonoids in Cistanche deserticola Y.C.Ma could reach（13.04±0.06）%.The best aqueous two-phase separation system was EtOH-K2HPO4.The optimal ratio between ethanol and water,mass concentration of potassium hydrogen phosphate anhydrous and volume fraction of flavonoids extract were 0.7（mL∶mL）,0.2 g/mL and 14%，respectively．The concentration of the total flavonoids in Cistanche deserticola Y.C.Ma was enriched 2.85 times with aqueous two-phase extraction．The highest scavenging rates of total flavonoids of DPPH·and·OH were 91.8%and 35.9%respectively,indicating that the total flavonoids scavenging effect of DPPH·on free radical was stronger than that of·OH.

Cistanche deserticola Y.C.Ma;total flavonoids;orthogonal experiment;the system of EtOH-K2HPO4; antioxidant ability

2016-12-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“古爾班通古特沙漠荒漠肉蓯蓉種質(zhì)資源遺傳多樣性研究”（31460070）

肖星輝（1995—），男（漢），本科生，研究方向：生化與分子生物學(xué)的研究。

*通信作者：李予霞（1970—），女，副教授，研究方向：藥物資源的開發(fā)研究。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.002