香菇液體培養基優化及其體外抗氧化活性研究

馬銀鵬，于麗萍，2，馬鳴，韓冰，孔祥輝，2，*

（1.黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010；2.黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江哈爾濱150020；3.哈爾濱商業大學，黑龍江哈爾濱150028）

香菇液體培養基優化及其體外抗氧化活性研究

馬銀鵬1，于麗萍1，2，馬鳴3，韓冰3，孔祥輝1，2，*

（1.黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010；2.黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江哈爾濱150020；3.哈爾濱商業大學，黑龍江哈爾濱150028）

以香菇液體發酵胞外粗多糖得率為主要評價指標，通過正交試驗研究液體發酵最優培養基配方；測定胞外和胞內粗多糖中蛋白質、還原糖和多糖含量，并研究其體外對羥自由基和DPPH自由基的清除率。結果表明：香菇液體發酵最優配方為葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麥麩皮24 g。此配方下香菇胞外粗多糖中蛋白質含量0.68%，還原糖含量6.17%，多糖含量25.6%；胞內粗多糖中蛋白質含量1.16%，還原糖含量7.01%，多糖含量32.3%；胞外粗多糖對羥自由基清除率為63.05%，對DPPH自由基清除率為62.05%。

香菇；液體培養；多糖；抗氧化活性

香菇，又名花菇、香蕈、冬菇，是世界第二大食用菌，稱為“山珍之王”[1]。香菇含有香菇多糖，具有分支的β-（1-3）-D-葡聚糖[2-3]，是一種宿主免疫增強劑[4-5]，具有抗腫瘤[6]、調節免疫功能[7]、抗病毒[8]、刺激干擾素生成、保肝解毒等多種活性[2-3，9]，目前已作為免疫增強劑用于臨床治療。香菇多糖具有很強抗衰老和抗氧化等活性[2，10-12]，研究香菇多糖抗氧化活性有助于降低細胞衰老速度，達到延年益壽的目的。因此，研究其抗氧化性對香菇多糖進一步產業化開發具有極大潛在價值[13]。

目前，人們對香菇多糖的研究和開發利用主要集中在子實體多糖的研究上，而利用香菇菌絲體的研究報道較少[14]。液體深層發酵技術可生產食用菌菌絲體，同時獲得具有功效成分的發酵液[15]。用工業化液體發酵技術生產食用菌蛋白質，比飼養家禽或家畜來獲取蛋白質的時間短、效率高、成本低[16]。因此，食用菌深層發酵在食品工業方面有很大發展，有望成為21世紀人類所需主要蛋白質的來源之一。液體發酵食用菌菌絲體還可用于制藥，對于在人工栽培條件下不易形成子實體或者其菌絲體與子實體含相類似有效成分的蕈菌，可利用發酵產物代替子實體[15]。目前，我國市場上供應的食用真菌藥物，如蜜環片、靈芝菌片、寧心寶膠囊等均已采用液體發酵菌絲體生產[17]。食用菌的培植開始從農業生產跨入了工業化生產時代[18]。

本研究以香菇為研究對象，通過正交試驗獲得最優培養基配方，并提取香菇發酵體系的胞內粗多糖和胞外粗多糖，測定粗多糖中蛋白質、還原糖和多糖含量，并研究其對羥自由基和DPPH自由基清除率，為香菇多糖抗氧化產品的研發奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

香菇菌株2205：黑龍江省科學院微生物研究所；馬鈴薯、麥麩皮：市售。

1.1.2 試驗試劑和主要儀器

硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖、苯酚、硫酸（均為分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250：上海星科生物技術有限公司；重蒸酚：北京索萊寶科技有限公司；牛血清蛋白：北京奧博星生物技術有限公司；3，5-二硝基水楊酸：合肥博美生物科技有限公司；硫酸亞鐵、水楊酸：天津市光復精細化工研究所；酵母膏：上海緣泰生物有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基（DPPH）：納川生物技術工作室。

臺式高速高性能冷凍離心機TGL20M-II：湖南凱達科學儀器有限公司；臥式精密搖床ZHWY-211B：河北德科機械科技公司；紫外可見分光光度計UV757CRT：上海儀電分析儀器有限公司；旋轉蒸發儀RE-53AA：北京瑞成偉業儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 香菇菌種活化

取200 g去皮馬鈴薯切片，煮沸30 min，濾液加酵母膏2 g、葡萄糖20 g、MgSO41.5 g、KH2PO41 g，定容至1 000 mL，121℃濕熱滅菌30 min。接種后于25℃，180 r/min培養10 d。

1.2.2 香菇最優培養基配方研究

采用兩種碳源（葡萄糖和可溶性淀粉）、兩種氮源（酵母膏和麥麩皮），選擇L9（34）正交表設計正交試驗，每組3個重復。其中KH2PO4和MgSO4分別為0.1 g，維生素B12 mg。正交試驗因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.3 香菇粗多糖提取

1.2.3.1 菌絲體處理

用八層紗布過濾香菇發酵菌液，沉淀用蒸餾水洗滌至無色后備用，濾液于4℃冰箱保存備用。

1.2.3.2 胞外粗多糖的制備

采用旋轉蒸發儀，75 r/min，將過濾后的發酵液旋轉蒸發至約10 mL，用3倍體積的95%乙醇沉淀，4℃醇沉12 h，5 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用80%的乙醇潤洗3次，于60℃烘干，獲得胞外多糖粗樣品。

1.2.3.3 胞內粗多糖的制備

取過濾后的沉淀物，加30倍蒸餾水，用勻漿器打勻，95℃浸提1 h，4 000 r/min離心20 min，取上清液1。對沉淀物重復上述操作，獲得上清液2。上清液1和上清液2混合，旋轉蒸發至約10 mL，用3倍體積95%乙醇，4℃醇沉12 h后，5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀用80%乙醇潤洗3次，于60℃烘干，獲得胞內多糖粗樣品。

1.2.4 考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量

稱取考馬斯亮藍G-250 100 mg，溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，并用蒸餾水定容至1000 mL，備用。稱取牛血清蛋白，用蒸餾水配成100μg/mL的標準溶液。依次吸取牛血清蛋白溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL入試管中，以水補足至1.0 mL，加入考馬斯亮藍G-2505mL，于595nm處測定吸光度，以蒸餾水作對照，繪制標準曲線。稱取粗多糖0.1 g，用100 mL蒸餾水溶解，5 000 r/min離心5 min取上清液，吸取上清液1 mL，加入考馬斯亮藍G-250 5 mL，測定同標準溶液，計算可溶性蛋白含量。

1.2.5 3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量

準確稱取烘干至恒重葡萄糖200 mg，配制2 mg/mL葡萄糖標準溶液。依次吸取葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL到5支試管中，以水補足至1.0 mL，分別加入DNS 2 mL，沸水浴中加熱2 min，取出置冰水中迅速冷卻，分別加入蒸餾水9 mL，搖勻，于540 nm處測定吸光度，以蒸餾水作對照，繪制標準曲線。稱取粗多糖0.1 g，用100 mL蒸餾水溶解，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液1 mL，加DNS 2 mL，處理同標準溶液，計算多糖含量。

1.2.6 苯酚硫酸法測多糖含量

稱取100 mg烘干至恒重葡萄糖，加水溶解定容至100 mL，得葡萄糖標準溶液。分別取葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL加入8支試管中，以水補足至2.0 mL，加入體積分數為5%的重蒸酚溶液1 mL，5 mL濃硫酸，迅速振蕩均勻。100℃水浴15 min，迅速于冰水中冷卻，于490 nm處測定吸光度，以蒸餾水作對照，繪制標準曲線。稱取粗多糖0.1 g，用100 mL蒸餾水溶解，5 000 r/min離心5 min取上清液，吸取上清液1 mL，加蒸餾水補足至2 mL，處理同標準溶液，計算多糖含量。

1.2.7 羥自由基清除率的測定

胞外粗多糖樣液濃度為2 mg/mL。在A0試管中分別加入硫酸亞鐵1 mL、水楊酸1 mL、蒸餾水2 mL、H2O21 mL，不加樣品溶液。在AX中分別加入硫酸亞鐵1 mL、水楊酸1 mL、蒸餾水2 mL、H2O21 mL、樣品溶液2 mL。在AX0中分別加入硫酸亞鐵1 mL、水楊酸1 mL、蒸餾水2 mL、樣品溶液2 mL，不加H2O2。最后將每支試管加蒸餾水補足至7mL，再于510nm處測定吸光值。再將粗多糖樣液稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，并分別配置0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的VC溶液，在相同操作下測定吸光值，對比多糖溶液和VC溶液和清除率的關系。

式中：A0為空白樣的吸光值，即不加樣品溶液；Ax為樣品組的吸光值，即加顯色劑H2O2和樣品溶液；Ax0為樣品本底吸光值，即不加顯色劑H2O2。

1.2.8 DPPH自由基清除率的測定

胞外粗多糖樣液濃度為2 mg/mL。取2 mL試樣于試管中，加入DPPH溶液2 mL，充分搖勻后，室溫下避光靜置30 min，于517 nm處測定吸光度。再將粗多糖樣液稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，并分別配置0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的VC溶液，在相同操作下測定吸光值，對比多糖溶液和VC溶液和清除率的關系。

式中：A樣為DPPH和多糖均加入的體系；A對照為不加多糖溶液的體系；A空白為不加DPPH的體系。

2 結果與討論

2.1 香菇最優培養基配方

葡萄糖和可溶性淀粉作為香菇菌絲體的碳源，酵母膏和麥麩皮作為香菇菌絲體的氮源，為香菇菌絲體生長提供必需營養成分。每種碳源和氮源添加量不同，胞外和胞內多糖產量存在差異。正交試驗表見表2。

表2 L9（34）正交試驗表Table 2 The L9（34）table of orthogonal test

以為葡萄糖（A）、酵母膏（B）、可溶性淀粉（C）、麥麩皮（D）為考察因素，以胞外多糖為評價指標，正交試驗設計與結果見表2。由極差分析可知，液體發酵培養基對胞外粗多糖產量的影響主次為A＞D＞C＞B。由方差分析可知最優方案為A3B3C2D3，即葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麥麩皮24 g。以此配方進行驗證試驗，此最優配方下胞外多糖含量為5.917 4 g。

以胞內多糖為評價指標，正交試驗設計與結果見表2。由極差分析可知，液體發酵培養基對胞內粗多糖產量的影響主次為A＞C＞D＞B。由方差分析可知最優方案為A3B1C1D3，即葡萄糖9 g、酵母膏0.3 g、可溶性淀粉3 g、麥麩皮24 g。以此配方進行驗證試驗，此最優配方下胞內多糖含量為0.821 3 g。

綜合胞外多糖和胞內多糖正交試驗結果和驗證試驗結果，選擇以胞外多糖得率為評價指標，香菇液體發酵最優培養基配方為葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麥麩皮24 g。

2.2 可溶性蛋白含量測定

蛋白質濃度標準曲線如圖1所示，回歸方程為Y= 0.059X+0.0001，R2=0.993。

圖1 蛋白質濃度標準曲線Fig.1 The standard curve of protein concentration

測得香菇胞內粗多糖中蛋白質含量為1.16%，胞外粗多糖中蛋白質含量為0.68%。

2.3 還原糖含量測定

葡萄糖濃度標準曲線如圖2所示，回歸方程為Y= 0.743X-0.020，R2=0.997。

圖2 葡萄糖濃度標準曲線Fig.2 The standard curve of glucose concentration

測得香菇胞內粗多糖中還原糖含量為7.01%，胞外粗多糖中還原糖含量為6.17%。

2.4 多糖含量測定

葡萄糖濃度標準曲線如圖3所示，回歸方程為Y= 0.012X-0.010，R2=0.997。測得香菇胞內粗多糖中多糖含量為32.3%，胞外粗多糖中多糖含量為25.6%。

2.5 羥自由基清除率測定

香菇胞外粗多糖對羥自由基清除率為（60.67± 1.09）%。不同多糖和VC濃度下羥自由基清除率結果如圖4所示。

羥自由基清除率均隨多糖濃度和VC濃度的增加而提高。當濃度小于1.0 mg/mL時，香菇胞外多糖較VC對羥自由基清除率大，當濃度為1.0 mg/mL時，兩者對羥自由基清除率基本相當。

圖3 葡萄糖濃度標準曲線Fig.3 The standard curve of glucose concentration

圖4 不同多糖與VC濃度對羥自由基的清除率Fig.4 The clearance rate of hydroxyl radical with different polysaccharide and VCconcentration

2.6 DPPH自由基清除率測定

香菇胞外粗多糖對DPPH自由基清除率為（60.57± 2.02）%。不同多糖濃度和不同VC濃度下DPPH自由基清除率結果如圖5所示。

圖5 不同多糖與VC濃度對DPPH自由基的清除率Fig.5 The clearance rate of DPPH with different polysaccharide and VCconcentration

隨著多糖濃度的增加，對DPPH自由基的清除率逐漸增加，但是VC濃度對DPPH自由基的清除率基本保持在一個較高水平。隨著濃度增加，多糖和VC對DPPH自由基的清除率逐漸接近。

3 結論

以胞外粗多糖產量為指標，正交試驗獲得香菇液體發酵培養基最優配方：葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麥麩皮24 g。此配方下香菇胞外粗多糖中可溶性蛋白含量為0.68%，還原糖含量為6.17%，多糖含量為25.6%；胞內粗多糖中可溶性蛋白含量為1.16%，還原糖含量為7.01%，多糖含量為32.3%。

香菇液體發酵胞外粗多糖對羥自由基清除率為60.67%，較VC對羥自由基清除率好；對DPPH自由基清除率為60.57%，隨著濃度增加，多糖和VC對DPPH自由基的清除率逐漸接近。

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The Optimal Formula of Liquid Medium on Lentinus edodes and Its Antioxidant Activities in vitro

MA Yin-peng1，YU Li-ping1，2，MA Ming3，HAN Bing3，KONG Xiang-hui1，2，*
（1.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，Heilongjiang，China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150020，Heilongjiang，China；3.Harbin University of Commerce，Harbin 150028，Heilongjiang，China）

The extracellular polysaccharide yields of Lentinus edodes liquid fermentation was took as main evaluation index to determine the optimal formula of liquid fermentation medium.The protein，reducing sugar and polysaccharide content of extracellular and intracellular polysaccharide was also studied.Then its clearance rate to hydroxyl radical（·OH）and DPPH·was studied in-vitro.The results showed that the optimal formula of L.edodes liquid fermentation contains glucose 9 g，yeast extract 0.9 g，soluble starch 6 g，wheat bran 24 g.We found that the protein content in extracellular polysaccharide of L.edodes accounts for 0.68%，reducing sugar content was 6.17%，polysaccharides content was 25.6%；protein content in intracellular polysaccharide was 1.16%，reducing sugar content was 7.01%，polysaccharides content was 32.3%.The clearance rate of extracellular polysaccharide to hydroxyl radical was 63.05%，to DPPH free radicals was 62.05%.

Lentinus edodes；liquid medium；polysaccharides；antioxidant activities

2016-12-09

黑龍江省科研機構創新能力提升專項計劃（YC2015D002）

馬銀鵬（1987—），男（漢），助理研究員，碩士，研究方向：食用菌功效成分分離純化及活性研究。

*通信作者

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.003