利用檸檬酸脫除鰱魚魚鱗中鈣的工藝條件優化

胡愛軍，宋飛瑩，鄭捷，曲瑩，曹園園

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2天津市寬達水產食品有限公司，天津300304）

利用檸檬酸脫除鰱魚魚鱗中鈣的工藝條件優化

胡愛軍1，2，宋飛瑩1，鄭捷1，曲瑩1，曹園園1

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2天津市寬達水產食品有限公司，天津300304）

以檸檬酸為脫鈣劑，研究攪拌條件下鰱魚魚鱗的脫鈣條件，并通過掃描電子顯微鏡對脫鈣前后魚鱗的表面結構進行觀察對比。采用單因素及正交試驗，考察料液比、脫鈣時間及檸檬酸濃度對魚鱗脫鈣效果的影響。結果表明，最佳工藝參數為：料液比1∶20（g/mL），脫鈣時間120 min，檸檬酸濃度3.5%，在此條件下，脫鈣率可達到95.23%，電鏡結果顯示，脫鈣能使鰱魚魚鱗的蛋白質裸露出來，有利于魚鱗蛋白質的提取。

鰱魚；魚鱗；檸檬酸；脫鈣；表面結構

中國作為淡水魚大國，其產量一直穩居世界前列[1]。白鰱（Hypophthalmichthys molitrix），作為中國四大家魚之一，飼養廣泛，2015年產量為435.5萬噸，少于草魚位居第二[2]。雖然我國淡水養殖業發展迅猛，但水產品的深加工與綜合利用都低于國際水平[3]，淡水魚的加工比例僅為17%，遠低于我國海水產品的加工比例（53.57%）[4]。在魚類加工中，大約30%的副產品由魚皮、魚鱗、魚骨組成，其中魚鱗約占其中的15%[5]。所有的后期副產品均含有豐富的蛋白質，這些材料也作為潛在的膠原蛋白和明膠來源得到了越來越多的關注[6]。魚鱗中的膠原蛋白纖維層的結構是正交式夾層結構，表面有一層羥基磷灰石的覆蓋[7]，這種結構增加了魚鱗的加工利用難度，也直接導致了鰱魚魚鱗不能廣泛加工利用以及大量廢棄的現狀。

要將魚鱗中的蛋白質提取出來，必須先對魚鱗進行脫鈣處理。目前，對魚鱗脫鈣的方法主要集中在鹽酸、檸檬酸脫鈣和EDTA絡合法脫鈣。劉冬姣等[8]利用響應面法進行了EDTA-4Na脫除魚鱗鈣的工藝優化研究，但是文中并沒有指明所用魚鱗的種類，不同魚鱗脫鈣條件可能會有所不同；黃煜等[9]進行了鹽酸脫除羅非魚魚鱗鈣的工藝優化研究；陳正平等[10]用單因素正交試驗研究了磁力攪拌輔助檸檬酸脫除鳙魚魚鱗鈣的工藝；彭元懷等[11]進行了單因素正交試驗優化檸檬酸法脫除羅非魚魚鱗鈣的工藝研究；陳日春[12]研究了EDTA螯合脫除鰱魚魚鱗中鈣離子的工藝條件，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗優化得到最優的脫鈣工藝條件。

考慮到脫鈣后的蛋白質提取試驗，有研究表明，相比于EDTA法和檸檬酸脫鈣法，鹽酸脫鈣在脫鈣的過程中會造成較大的蛋白質損失[6]。而EDTA脫鈣法成本較高，目前在工業生產中應用可能性不大。本文采用檸檬酸進行脫鈣，不僅具有較小的蛋白質損失率，同時還能得到具有生物活性的檸檬酸鈣。因此用檸檬酸進行魚鱗脫鈣可以達到綜合利用的目的，實現資源最大化利用[13]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鰱魚魚鱗：收集于天津濱海金元寶農貿市場。

檸檬酸、氨水、氯化銨、鉻黑T、鹽酸羥胺、三乙醇胺、氯化鈣、EDTA-2Na、硝酸、高氯酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸、甲基紅、溴甲酚綠、95%乙醇、濃硫酸、石油醚：均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

FA2204B電子天平：諸暨市超澤衡器有限公司；D-8401WZ電動攪拌器：天津市華興科學儀器廠；DH-101電熱恒溫鼓風干燥箱：天津市中環實驗電爐有限公司；K9840半自動凱氏定氮儀、S0X406脂肪分析儀：濟南海能儀器股份有限公司；QSL-08消化爐：天津市天宇實驗儀器有限公司；SU-1510掃描式電子顯微鏡：日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 鰱魚魚鱗基本成分測定

水分測定：GB 5009.3-2010《食品安全國家標準食品中水分的測定》直接干燥法；灰分含量的測定：GB 5009.4-2010《食品安全國家標準食品中灰分的測定》馬福爐灰化法；脂肪含量的測定：GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》索氏抽提法；蛋白質含量的測定：GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》微量凱氏定氮法。

1.2.2 魚鱗脫鈣工藝

原料魚鱗反復清洗，去除雜質后40℃烘至魚鱗表面完全干燥，浸入酸液中，攪拌使體系處于全混流狀態，脫鈣一段時間，過濾，棄去濾液。脫鈣魚鱗用蒸餾水反復沖洗，40℃干燥備用。

1.2.3 脫鈣率測定

原料總鈣離子含量及脫鈣液中的鈣離子含量用EDTA絡合滴定法測定[13]。

脫鈣率計算：

式中：h1為脫鈣液中的鈣離子含量，mg/mL；h0為總鈣離子含量，mg/g；v為脫鈣液總體積，mL；m為脫鈣魚鱗質量，g。

1.2.4 不同因素對脫鈣率的影響

檸檬酸濃度對脫鈣率的影響：稱取一定量魚鱗，按料液比1∶20（g/mL）分別加入不同濃度（質量分數）的檸檬酸溶液（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%），攪拌脫鈣120 min，考察檸檬酸濃度對脫鈣率的影響。

脫鈣時間對脫鈣率的影響：稱取一定量魚鱗，按料液比1∶20（g/mL）加入2.5%的檸檬酸溶液，進行攪拌脫鈣，測定不同脫鈣時間（10、20、40、60、80、100、120、160、200 min）下的脫鈣率，考察脫鈣時間對脫鈣率的影響。

料液比對脫鈣率的影響：稱取一定量魚鱗，分別按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g/mL）加入濃度為2.5%的檸檬酸溶液，攪拌脫鈣120 min，考察不同料液比對脫鈣率的影響。

1.2.5 脫鈣工藝參數優化

以檸檬酸濃度，反應時間，料液比為影響因素，依據單因素試驗的結果選擇合適的影響因素水平，以脫鈣率為考察指標，設計三因素三水平L9（34）的正交試驗。

1.2.6 魚鱗脫鈣前后表面結構分析

將脫鈣前的鰱魚魚鱗與脫鈣后的魚鱗冷凍干燥后，表面噴金，于掃描電子顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 鰱魚魚鱗基本成分

鰱魚魚鱗基本成分測定結果見表1。

表1 鰱魚魚鱗基本成分分析Table 1 The composition analysis of silver carp scale

表1表明，鰱魚魚鱗中蛋白質含量為64.23%，充分說明了魚鱗蛋白綜合利用的必要性。灰分含量較高，在提取蛋白之前需要先進行脫鈣處理。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 鈣離子標準曲線

鈣離子標準曲線圖見圖1。

圖1 鈣離子標準曲線Fig.1 Standard curve of Ca2+

根據數據繪制標準曲線，擬合出回歸方程為：y=0.089 7x-0.142 6

式中y為鈣離子濃度，mg/mL；x為EDTA滴定體積，mL；相關系數R2=0.999 8，相關性良好。

2.2.2 檸檬酸濃度對脫鈣率的影響

檸檬酸濃度對脫鈣率的影響見圖2。

圖2 檸檬酸濃度對脫鈣率的影響Fig.2 Effect of citric acid concentration on decalcification rate

由圖2可知，檸檬酸濃度低于2.5%時，隨著檸檬酸濃度的增大，脫鈣率持續升高，當檸檬酸濃度超過2.5%后，隨檸檬酸濃度的增大，脫鈣率的升高不再明顯，3.5%之后逐漸趨于穩定。原因可能是，檸檬酸濃度較低時，提高反應物的濃度，能夠加快鈣離子與檸檬酸的反應速率，使脫鈣率呈上升趨勢。當檸檬酸濃度超過2.5%后，此時體系中的檸檬酸已經能夠滿足鈣離子的反應需求，體系已趨于平衡，此時提高檸檬酸濃度，脫鈣率不再上升。

2.2.3 脫鈣時間對脫鈣率的影響

脫鈣時間對脫鈣率的影響見圖3。

圖3 反應時間對脫鈣率的影響Fig.3 Effect of reaction time on decalcification rate

由圖3可以看出，脫鈣時間小于120 min時，隨著脫鈣時間的增加，脫鈣率不斷升高，當脫鈣時間超過120 min后，進一步提高反應時間，脫鈣率升高不再明顯。可能的原因是，時間小于120 min時，隨著時間增加，魚鱗中的鈣離子與檸檬酸有了更多的接觸時間，反應更易趨近平衡，使脫鈣率呈持續上升趨勢。當時間大于120 min后，反應體系中的鈣離子已經基本反應完全，脫鈣率不會再隨著時間的增加升高。

2.2.4 料液比對脫鈣率的影響

料液比對脫鈣率的影響見圖4。

圖4 料液比對脫鈣率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on decalcification rate

料液比從1∶10（g/mL）變化到1∶20（g/mL），脫鈣率不斷上升，當料液比達到1∶20（g/mL）后，進一步提高溶液體積對脫鈣率的影響并不顯著，這可能是因為當檸檬酸濃度不變時，隨著溶液體積的增加，魚鱗分散得更完全，與檸檬酸的接觸更加充分，從而有利于脫鈣率的提高；當料液比增加到1∶20（g/mL）之后，魚鱗中鈣離子對檸檬酸的需求基本達到飽和狀態，增加溶液體積，脫鈣率不再升高。

2.3 正交試驗結果

選擇檸檬酸濃度、脫鈣時間、料液比為考察因素，以脫鈣率為考察指標，每個因素取3個水平，采用L9（34）正交表進行正交試驗優化脫鈣工藝。正交試驗因素與水平見表2，試驗結果見表3。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

表3 L9（34）正交試驗極差分析結果Table 3 Range analysis of L9（34）orthogonal test

由表3中極差R可知各因素對魚鱗脫鈣效果影響程度相對大小的順序為：檸檬酸濃度＞反應時間＞料液比。由脫鈣率所確定的最優工藝條件組合為A3B2C2，即檸檬酸濃度3.5%，脫鈣時間120 min，料液比1∶20（g/mL）。

為了明確各因素對脫鈣率影響的顯著性，進一步對表3中的試驗結果進行方差分析，方差分析結果見表4。

表4 方差分析表Table 4 Results of variance analysis

由表4方差分析結果表明，各因素對脫鈣率均有影響，其中，檸檬酸濃度對脫鈣率有極顯著影響，脫鈣時間對脫鈣率有顯著影響，料液比對脫鈣效果有一定影響。這表明在檸檬酸脫鈣過程中，檸檬酸濃度和脫鈣時間是決定脫鈣率的關鍵因素。

由正交試驗結果得到的脫鈣最佳工藝參數為檸檬酸濃度3.5%，脫鈣時間120min，料液比1∶20（g/mL）。這個組合沒有出現在正交表中，因此需要對正交結果進行驗證：驗證試驗平行做3次，取平均值，測得其驗證產品的脫鈣率為95.23%，大于正交表中的最大值92.30%，因此試驗最終確定的脫鈣最佳工藝參數為：檸檬酸濃度3.5%，脫鈣時間120 min，料液比1∶20（g/mL）。

2.4 脫鈣后鰱魚魚鱗基本成分

脫鈣后魚鱗基本成分見表5。

表5 脫鈣后鰱魚魚鱗基本成分分析Table 5 The composition analysis of decalcified silver carp scale

由表5，脫鈣后魚鱗中蛋白含量達到了86.9%，基本上可以算是一種粗蛋白了，鈣質的脫除能夠降低魚鱗蛋白質提取的難度。

2.5 脫鈣前后魚鱗表面結構分析

為了更直觀地分析脫鈣對魚鱗表面結構的影響，對脫鈣前后魚鱗表面結構進行了掃描電鏡觀察。結果見圖5、圖6。

圖5 未脫鈣魚鱗表面結構Fig.5 The surface structure of undecalcified scale

通過電鏡掃描結果比較，未脫鈣的魚鱗表面比較平整致密，未見明顯的突起或凹陷，這是由于魚鱗表面被羥基磷灰石等無機礦物質覆蓋；經過脫鈣處理的魚鱗表面變得粗糙，出現規則排列的明顯條紋狀突起，這是由于魚鱗表面鈣質被脫除，魚鱗中纖維狀的蛋白質結構裸露出來，并且表面結構變得疏松，這有利于后續蛋白質的提取。

圖6 脫鈣后魚鱗表面結構Fig.6 The surface structure of decalcified scale

3 結論

檸檬酸脫鈣可以脫去大部分的鈣質，使魚鱗表面結構變得疏松，有利于后續蛋白質的提取。影響脫鈣率的因素主次大小順序為檸檬酸濃度＞反應時間＞料液比，其中檸檬酸濃度和反應時間是影響脫鈣率的顯著因素。通過單因素和正交試驗最終確定檸檬酸脫鈣的最優工藝參數為：在攪拌條件下，檸檬酸濃度為3.5%，反應時間為120 min，料液比為1∶20（g/mL）。在此條件下脫鈣率為95.23%，脫鈣效果良好。

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Study on Decalcification Condition of Silver Carp（Hypophthalmichthys molitrix）Scales with Citric Acid

HU Ai-jun1，2，SONG Fei-ying1，ZHENG Jie1，QU Ying1，CAO Yuan-yuan1
（1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China；2.Tianjin City Kuanda Aquatic Food Co.,Ltd.,Tianjin 300304,China）

The process conditions of citric acid removal the calcium ions from the silver carp fish-scale were studied.The surface structures of undecalcified fish scale and decalcified fish scale were observed by scanning electron microscope（SEM）.The effects of solid-liquid ratio，reaction time and citric acid concentration on the decalcification of fish scales were investigated and the optimal technological parameters were separately to be 1∶20（g/mL），120 min and 3.5%.Under the optimal conditions，decalcification rate was 95.23%.SEM results showed that decalcification could be favorable for the extraction of fish scale protein.

silver carp；fish scale；citric acid；decalcification；surface structure

2016-12-07

中國博士后科學基金面上資助項目（2013M540211）；天津市農業科技成果轉化與推廣項目“天津兩種優勢魚種中餐工業化調理食品加工關鍵技術的開發與應用”；天津科技大學科學研究基金資助項目（20110104）；天津市東麗區科技型中小企業發展專項資金產學研合作項目“復合型魚糜制品加工關鍵技術開發與應用”

胡愛軍（1968—），男（漢），教授，研究生導師，博士，研究方向：食品加工及超聲技術。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.017