LC-MS/MS 法測定豬肉中泰妙菌素及8-α-羥基泰妙菌素

范宏

（承德護理職業學院，河北承德067000）

LC-MS/MS 法測定豬肉中泰妙菌素及8-α-羥基泰妙菌素

范宏

（承德護理職業學院，河北承德067000）

采用磷酸緩沖液-乙酸乙酯混合提取、正己烷除脂、MCX柱凈化，采用液相色譜-質譜法（LC-MS/MS）建立了同時測定豬肉中泰妙菌素及8-α-羥基泰妙菌素殘留量的分析方法。結果表明：在泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素加標濃度5.0 μg/kg～500.0 μg/kg范圍內，相關系數分別為0.999 8和0.999 7，線性關系良好；檢測限（LOD）分別為1.5 μg/kg和3.0 μg/kg，定量限（LOQ）分別為5.0 μg/kg和10.0 μg/kg；平均回收率為83.4%～97.6%，相對標準偏差（RSD）為2.4%～5.3%。

泰妙菌素；8-α-羥基泰妙菌素；液相色譜-質譜法；豬肉

泰妙菌素（pleuromulin），又稱泰妙霉素、泰妙靈，分子式為C28H47NO4S，CAS號為55297-95-5，是一種雙萜烯類畜禽專用抗生素[1-2]，其抗菌譜與大環內酯類抗生素相近，用于畜禽呼吸道疾病及支原體關節炎等疾病的防治，目前是被全球廣泛應用的主要獸用抗生素[2-4]。低劑量的泰妙霉素可提高飼料利用率，促進動物生長，但過量使用可導致泰妙霉素在體內殘留或蓄積，并可通過食物鏈進入人體，危害人類健康。美國、歐盟、日本都明確規定了泰妙菌素最高殘留限量（MRL），我國農業部235號規定了泰妙菌素及其代謝產物8-α-羥基泰妙菌素的總量，在豬體內組織最高殘留限量：肌肉100 μg/kg，肝臟500 μg/kg[5]。但目前缺乏關于8-α-羥基泰妙菌素的檢測方法標準。

當前關于泰妙菌素的檢測方法主要有微生物法[3]、氣相色譜法（GC）[2]、液相色譜法（HPLC）[6-7]、液相色譜-質譜法（LC-MS/MS）[8-11]，其中微生物法前處理繁瑣，準確度差；GC需要衍生化，操作復雜，精密度差；HPLC盡管儀器普及面廣、定量準確，但是檢出限高，無法用于低濃度獸藥殘留檢測；LC-MS/MS具有檢出限低，選擇性高、靈敏度強等特點而廣泛應用。本文采用磷酸緩沖液-乙酸乙酯混合提取、正己烷除脂、MCX柱凈化，采用液相色譜-質譜法（LC-MS/MS）同時測定豬肉中泰妙菌素及8-α-羥基泰妙菌素殘留量，該方法檢出限低，精密度好，準確度高，可用于進出口豬肉中泰妙菌素及其代謝產物8-α-羥基泰妙菌素殘留量檢驗檢測的要求，并為畜禽食品中泰妙菌素殘留量檢測方法標準的制修訂提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑材料

Waters Acquity UPLC XEVO TQ MS型超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀：沃特世科技（上海）有限公司；Maxi Mix II型漩渦震蕩器：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；XT-NS 1型全自動氮吹濃縮儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；Milli-Q REFERENCE型超純水系統：密理博中國有限公司；R-300型旋轉蒸發儀：瑞士步琦有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司。

泰妙菌素標準物質（純度≥99%)：瑞士CARBOGEN AMCIS AG公司；8-α-羥基泰妙菌素標準物質（純度≥99%）：山德士（中國）制藥有限公司；甲醇、丙酮、正己烷、甲酸（均為色譜純)：默克投資（中國）有限公司；濃鹽酸、二氯甲烷、氫氧化鈉（均為分析純)：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 溶液配制

分別稱取泰妙菌素、8-α-羥基泰妙菌素各100.0mg（精確至0.1 mg），用適量甲醇溶解后，置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻線，配制成各目標物濃度為2.0 mg/mL標準儲備溶液，-20℃避光保存。分別吸取適量泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標準儲備溶液，先用甲醇配制成各目標物濃度為100 μg/mL的混合標準溶液，然后用20%甲醇溶液逐級稀釋配制濃度為5、10、50、100、200 ng/mL的系列混合標準工作液，4℃避光保存。

磷酸緩沖液（pH=8.0)：稱取0.52 g KH2PO4，16.73 g K2HPO4，以三蒸水定容至500 mL。磷酸緩沖液（pH= 4.5)：在磷酸緩沖液（pH=8.0）中滴加磷酸使其pH值為4.5。

1.3 LC-MS/MS

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100mm，1.7μm）；柱溫為35℃；流動相A為純甲醇；流動相B為0.1%甲酸水溶液；流速：0.2 mL/min，進樣量為10 μL。梯度洗脫程序為0.0 min～0.1 min，20% A；0.1 min～3.5 min，90%A；3.5 min～4.5 min，20%A；4.5 min～5.0 min，20%A。

質譜條件：電離方式為電噴霧電離，正離子模式ESI（+）；檢測方式：多重反應監測（MRM）；離子源溫度為150℃；脫溶劑氣為氮氣，氣速9.5L/min，溫度350℃；錐孔氣為氮氣，氣速1.0 L/min；碰撞氣為氬氣；其它質譜條件見表1。

1.4 樣品前處理

準確稱取5 g樣品（精確至0.1 mg），加入5 mL磷酸緩沖液（pH=8.0），勻漿后置于50 mL離心管中，加入20 mL乙酸乙酯超聲提取20 min，以6 000 r/min離心10 min，收集有機相。再用20 mL乙酸乙酯超聲提取2次，合并有機相后，旋轉蒸干，加入5 mL磷酸緩沖液（pH=4.5）溶解殘渣，再加入5 mL正己烷渦旋振蕩去脂，8 000 r/min離心5 min，取下層提取液經MCX固相萃取柱凈化，5 mL甲醇洗脫，45℃氮氣吹干后1 mL甲醇定容、溶解，經0.22 μm微孔濾膜過濾，供LC-MS/ MS測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，考察0.1%甲酸水-乙腈，0.1%甲酸水-甲醇，5 moL/L乙酸銨（含0.1%甲酸）-甲醇，5 moL/ L乙酸銨（含0.1%甲酸）-乙腈等不同流動相對泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的分離效果。結果顯示：以0.1%甲酸水-甲醇作為流動相，經梯度洗脫后，泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素與雜質峰實現很好的分離，峰形對稱，無拖尾和前延現象，響應值高，在5 min內全部出峰，節省了分析時間。豬肉加標樣品中泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素MRM色譜圖見圖1所示。

圖1 豬肉加標樣品中泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素MRM色譜圖Fig.1 Chromatogram of MRM of pleuromulin and 8-α-hydroxypleuromulin

2.2 質譜條件優化

根據目標化合物泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的結構特征，確定加合H+形成帶正電荷的母離子[M+H]+，因此選用ESI+為離子化模式，配制1 μg/mL的泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標準溶液，采用流動注射泵進樣，進行一級質譜掃描，確定準分子離子峰。同時對離子源溫度、干燥氣溫度、霧化器壓力等質譜參數進行優化，并以準分子離子采用MRM監測方式進行二級質譜掃描，優化碰撞能量，選擇兩個信噪比較高的特征子離子作為定量、定性離子對。結果顯示：泰妙菌素的準分子離子[M+H]+為m/z 494.3，產生m/z 192.1、119.1的子離子；8-α-羥基泰妙菌素的準分子離子[M+H]+為m/z 337.2，產生m/z 301.0、283.1的子離子，其具體質譜參數見表1。

表1 待測物部分質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters of the analytes

2.3 萃取溶劑的選擇

根據相似相容原理，泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素偏弱極性，故考察了丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚等不同萃取溶劑對泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素提取效率的影響見圖2。

圖2 不同萃取溶劑的提取率Fig.2 Extraction rate of different extraction solvents

從圖2中可知：按照泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素提取率高低順序依次為：乙酸乙酯（92.3%）＞二氯甲烷（89.4%）＞丙酮（83.7%）＞乙醚（78.6%），其中乙酸乙酯對泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素提取率最高，提取率分別為91.5%和93.1%，平均值92.3%；雖然乙酸乙酯對泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的萃取效率最高，可仍有部分油脂被萃取到提取液中，可對LCMS/MS儀器響應值有明顯的抑制作用，影響靈敏度，但經正己烷脫脂后，可有效提高其檢測響應值，從而提高LC-MS/MS檢測靈敏度。故選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑。

2.4 SPE凈化柱的選擇

通過樣品加標試驗，考察不同SPE凈化柱（MCX、SCX、C18、HLB、MAX、WAX）對泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的凈化效果見圖3。

圖3 不同凈化柱的凈化回收效果Fig.3 Purification and recovery effect of different purification column

結果表明，強陽離子交換柱（MCX和SCX）對泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的具有較好的凈化和濃縮作用，特別是MCX柱凈化回收率高達97.2%；弱陽離子交換柱（HLB、C18）回收率適中；而弱陰離子交換柱（MAX和WAX）凈化回收率較差。因此，選擇MCX固相萃取柱作為凈化柱。

2.5 基質效應

基質對目標物的分析可產生顯著的干擾，稱之為基質效應（Matrix effect，ME），嚴重的基質效應可直接影響測定結果的準確性，本文研究對象豬肉組織中基質復雜，含有大量的內源性化合物，所以考察了基質效應對LC-MS/MS的影響。在純甲醇溶液、空白豬肉基質中精確加入一定量的泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標準溶液，配制成低、中、高3種濃度溶液，按上述所建方法進行測定，比較純甲醇溶液和豬肉基質中被測組分的峰面積，計算基質效應（ME）=Ap/As，其中Ap指豬肉基質中被測組分的峰面積；As指純甲醇溶液中被測組分的峰面積；當ME＞1表示存在基質增強效應，當ME＜1表示存在基質抑制效應；M=1表示在曲線范圍濃度內基質對響應強度無影響?；|效應ME值見表2。

表2 基質效應ME值Table 2 ME value of matrix effect

從表2中可知：泰妙菌素的基質效應ME值在0.921～0.963，8-α-羥基泰妙菌素的基質效應ME值在0.923～0.984，即表明沒有明顯的基質增強或抑制效應。

2.6 線性范圍與檢出限

在豬肉空白樣品中，分別加入適量的泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標準溶液，制備成泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標準溶液濃度依次為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、500 μg/kg的試樣，按上述所建方法進行測定，以色譜峰面積（y）為縱坐標，被測組分的質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數；根據6個空白豬肉樣品的基線噪音求其平均值，按信噪比（RS/N=3）計算其方法檢測限（LOD），信噪比（RS/N= 10）計算其方法定量限（LOQ）（表3）。結果說明：泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素在加標濃度為5.0 μg/kg～ 500.0μg/kg范圍內，相關系數分別為0.9998和0.9997，線性關系良好；LOD分別為1.5 μg/kg和3.0 μg/kg，LOQ分別為5.0 μg/kg和10.0 μg/kg，這說明該方法靈敏度高，低于我國農業部公告第235號中關于動物性食品中獸藥最高殘留限量要求。線性方程、相關系數、檢測限和定量限見表3。

2.7 回收率與精密度

在豬肉空白樣品中分別加入線性范圍內低、中、高3種濃度的泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標準溶液，每個濃度平行測定6次，泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素標準溶液的回收率及相對標準偏差（RSD）如表4所示。

表3 線性方程、相關系數、檢測限和定量限Table 3 Linear relationship，correlation coefficients，LOD and LOQ

結果表明：泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素的平均回收率為83.4%～97.6%，RSD為2.4%～5.3%，符合獸藥殘留分析的準確度和精密度要求。

2.8 實際樣品的測定

隨即選取河北承德市農貿市場銷售的各種新鮮豬肉30份，按上述所建方法進行測定豬肉中泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素殘留量的測定。結果顯示：1份試樣中檢出含有泰妙菌素（213.8 μg/kg），陽性檢出率為3.3%；4份試樣中檢出含有8-α-羥基泰妙菌素（56.7 μg/kg～314.2 μg/kg），陽性檢出率為13.3%；8-α-羥基泰妙菌素陽性檢出率高于泰妙菌素陽性檢出率，這可能是由于部分豬肉中泰妙菌素經新陳代謝生成8-α-羥基泰妙菌素所導致的。檢測結果表明豬肉中存在一定量的泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素殘留。

3 結論

本文采用磷酸緩沖液-乙酸乙酯混合提取、水飽和正己烷除脂、MCX柱凈化，采用液相色譜-質譜法（LC-MS/MS）法建立了同時測定豬肉中泰妙菌素及8-α-羥基泰妙菌素殘留量的分析方法。結果表明：泰妙菌素和8-α-羥基泰妙菌素在加標濃度為5.0 μg/kg～500.0μg/kg范圍內，相關系數分別為0.9998和0.9997，線性關系良好；LOD分別為1.5 μg/kg和3.0 μg/kg，LOQ分別為5.0 μg/kg和10.0 μg/kg；平均回收率為83.4%～97.6%，RSD為2.4%～5.3%，該方法檢出限低，精密度好，準確度高，可用于進出口豬肉中泰妙菌素及其代謝產物8-α-羥基泰妙菌素殘留量檢驗檢測的要求，并為畜禽食品中泰妙菌素殘留量檢測方法標準的制修訂提供參考。

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Determination of the Content of Pleuromulin and 8-α-hydroxy-pleuromulin in Pork by LC-MS/MS

FAN Hong
（Chengde Nursing Career Academy，Chengde 067000，Hebei，China）

Extracting by using phosphate buffer and ethyl acetate mixed，and degreasing by n-hexane，and purifying by MCX column，the method was established for determination of the content of pleuromulin and 8-αhydroxy-pleuromulin in pork by liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）.The results showed that the correlation coefficients of pleuromulin and 8-α-hydroxy-pleuromulin were 0.999 8 and 0.999 7 in spiked concentration from 5.0 μg/kg to 500.0 μg/kg，and they had good linear relationsh.The limit of detection（LOD）were 1.5 μg/kg and 3.0 μg/kg，and the limit of quantification（LOQ）were 5.0 μg/kg and 10.0 μg/kg；the average recovery rate were from 83.4%to 97.6%，and relative standard deviations（RSD）were from 2.4%to 5.3%.

pleuromulin；8-α-hydroxy-pleuromulin；liquid chromatography mass spectrometry；pork

2016-11-16

范宏（1976—），女（漢），副教授，碩士，主要從事化學教學及研究工作。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.031