金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果與分析

陸其聰，鐘宇思，王立博，成曉情

（1.國家輕工業食品質量監督檢測成都站，四川成都610081；2.四川省輕工業研究設計院，四川成都610081）

金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果與分析

陸其聰1，2，鐘宇思1，2，王立博2，成曉情1，2

（1.國家輕工業食品質量監督檢測成都站，四川成都610081；2.四川省輕工業研究設計院，四川成都610081）

采用Baird-Parker（BP）平板計數法、顯色培養法分別對金黃色葡萄球菌能力驗證的兩個樣品進行定量檢測，考核樣品16-K717、16-Y374的菌落數分別為173 000、86 CFU/mL。試驗結果由中國檢驗檢疫科學研究院檢測中心給予評價，Z值分別為0.68、0.38，都取得了滿意結果。結果表明顯色培養法比Baird-Parker更適合于金黃色葡萄球菌的定量檢測。

金黃色葡萄球菌；定量檢測；能力驗證

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄球狀排列，無芽孢，無莢膜。它屬于嗜溫性微生物，能在7℃～48℃范圍內生長，在水分活度（0.86）和pH值（4.8）相對較低，高鹽和糖濃度達15 %及含有二氧化氮的環境中仍能生長。由于金黃色葡萄球菌能在較惡劣的環境中生長，使得它們能在其他微生物不能生長的許多食物中成為優勢種[1-3]。金黃色葡萄球菌能產生致病的腸毒素，健康成年人進食約30 g或30 mL含106～107個細胞數所產生100 ng～200 ng毒素的食物即可中毒，其特征是發病突然，來勢猛烈，通常在進食1 h～4 h出現臨床癥狀，特點是惡心，嘔吐，頭暈頭痛，腹痛腹瀉，重者可引起虛脫和休克。金黃色葡萄球菌毒素引起的食物中毒被認為是全球最常發生的食源性疾病[4]。近年來出現的“超級細菌”耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Stphylococcus aureus，MRSA）被發現存在于禽類體內，且感染率極高，由金黃色葡萄球菌引起的感染變得日益嚴重，并成為難治感染之一[5-7]，因而，準確地對食品中金黃色葡萄球菌的定量檢測就顯得尤為重要。

為了提高檢測能力和水平參與了中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織和負責實施的食品微生物學指示菌能力驗證[ACAS-PT187（2016）]。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品

金黃色葡萄球菌[編號FSCC223004（ATCC6538）]、表皮葡萄球菌[編號FSCC 223011（CMCC（B）26069）]：廣東環凱微生物科技有限公司；2瓶檢驗樣品凍干粉末（編號分別為16-K717、16-Y374)：中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心。

1.2 試劑與儀器

BP瓊脂基礎、腦心浸出液肉湯（BHI）、凍干血漿、卵黃亞碲酸鉀增菌劑：廣東環凱微生物科技有限公司；血瓊脂平板：鄭州安圖生物工程股份有限公司；科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養基：鄭州人福博賽生物技術有限公司。

YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DHG-9070A電熱恒溫干燥箱、AISET YLD-6000隔水式恒溫培養箱：廣東環凱微生物科技有限公司；BSC-1000ⅡA2生物安全柜：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌的定量檢測

BP平板計數法：樣品達到后立即于2℃～8℃冰箱保存，試驗前從冰箱中取出，使其達到室溫后開啟。瓶內加入4 mL無菌生理鹽水，待溶解后，吸出放入無菌瓶內，用36 mL無菌生理鹽水多次清洗樣品瓶，將樣品完全溶解在40 mL無菌生理鹽水中。以無菌吸管吸取25 mL樣品于225 mL滅菌生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成體積比1∶10的樣品勻液。用1 mL無菌吸管吸取體積比1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL無菌生理鹽水試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），換用1支1 mL無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成體積比1∶100的樣品勻液。依此類推，制成原液、10-1、10-2、10-3、10-4樣品液。依據GB 4789.10-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》第二法進行檢驗。

由于GB 4789.10-2010第二法存在涂布不均勻，耗時的情況，同時以接種量每皿為0.2 mL進行檢測，每個稀釋管做5個平行平板[8-9]，其它步驟與GB 4789.10-2010第二法相同。

顯色培養法：將41.3 g干粉緩慢倒入500 mL無菌水中，充分攪拌溶解，并加熱至100℃，直至瓊脂完全溶解。將培養基水浴冷卻至48℃，分別取1 mL上述濃度的樣品勻液于無菌培養皿中，每個濃度做2個平行，然后傾注（15±1）mL顯色培養基，混勻使其凝固、倒置，37℃培養24 h。

1.3.2 菌落計數及鑒定

BP平板上典型菌落的計數和確認按GB 4789.10-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》第二法進行。

顯色培養基上對紫紅色、紅色、粉紅色菌落進行計數。并將部分可疑菌落劃線于血平板，進行染色鏡檢和血漿凝固酶試驗。

2 結果

2.1 BP平板計數法

樣品16-K717在BP平板上菌落呈黑色，部分呈灰色，菌落周圍有渾濁帶，在其外層有透明圈的典型菌落。經鑒定，樣品16-K717中金黃色葡萄球菌為173 000 CFU/mL，結果見表1。

樣品16-Y374在BP上生長了大量雜菌，分別對不同形態的菌落進行計數和確認。通過對典型菌落的鑒定，表明典型菌落都是金黃色葡萄球菌，結果為86 CFU/mL，其它雜菌為干擾菌。

表1 樣品在BP平板上檢測結果Table 1 The results of samples on Baird-Parker plate

2.2 顯色培養基平板計數法

顯色平板上菌落大都為紫紅色、紅色和粉紅色，存在極少量的藍色菌落，對紫紅色、紅色和粉紅色進行計數，結果見表2。金黃色葡萄球菌顯色培養基上的可疑菌落通過血平板和血漿凝固酶試驗證實都為金黃色葡萄球菌。

2.3 兩種接種量在BP平板上檢測結果

兩種接種量在BP平板上檢測結果見表3。

表2 樣品在顯色培養基上檢測結果Table 2 The results of samples on chromogenic medium plate

表3 兩種接種量在BP平板上檢測結果Table 3 The results of samples on Baird-Parker plate by two methods

如表3所示，接種量0.2 mL的方法，樣品16-K717、16-Y374結果分別為182 000、99 CFU/mL，檢測結果比接種量0.3、0.3、0.4 mL的方法檢測結果偏高。2.4 檢測結果統計

表1、表2結果表明兩個樣品采用BP平板法與金黃色葡萄球菌顯色培養法的結果差異不明顯。從表3可以看出，接種量0.2 mL的方法，其檢測結果要高于接種量0.3、0.3、0.4 mL的方法。考慮到能力驗證選擇的方法為GB4789.10-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》第二法，因此上報結果為16-K717：173 000 CFU/mL；16-Y374：86 CFU/ mL。統計評價結果見表4。

表4 金黃色葡萄球菌定量檢測（BP平板法）統計評價結果Table 4 The quantitative test results of Staphylococcus aureus on Baird-Parker plate

反饋結果如表4所示，都取得了滿意結果。本次能力驗證共有80個實驗室參與，其中結果可疑的有7個，不滿意結果15個，共計60個實驗室獲得滿意結果，滿意率75%。

3 討論

傳統的BP法耗時長，選擇性不強，且受涂布時間、涂布均勻度等人員熟練程度因素影響，菌落有時分布不均勻而難以計數，從而影響試驗結果。這有可能是造成趙薇等用BP法與顯色培養法檢測結果差別大的原因[10]。在本文中，對BP平板涂布前做了一定的預處理，節約了涂布時間的同時使涂布更均勻，最終檢測結果與顯色培養法差異不大。

采用食品安全國家標準致病菌金黃色葡萄球菌的定量檢測BP法，將接種量0.3、0.3、0.4 mL的方法與接種量0.2 mL的方法進行比較，發現接種量為0.2 mL的結果偏高，這與王洪亮[8]等研究結果一致。當接種量較大時，涂布耗時，不容易均勻。而接種量小時，涂布更均勻，避免了菌落重疊現象出現，檢測結果更理想。因此，涂布的均勻性對檢測結果影響較大。這與我們對BP平板涂布前作預處理后得出的結論一致。

食品中金黃色葡萄球菌的檢測方法較多：BP法，顯色培養法，以分子生物學為基礎的快速檢測方法，以計算機為基礎的計算機視覺技術等[11]，我國食品中金黃色葡萄球菌定量檢測的檢測方法是傳統的BP法，其它方法尚未大規模推廣。從表2和表4中發現金黃色葡萄球菌顯色培養法Z值更接近中位值，由此認為顯色培養法在金黃色葡萄球菌的定量檢測中更具優勢。顯色培養基選擇性強，培養時間短，操作簡單，能對金黃色葡萄球菌進行有效區分，節約了檢測時間。所以顯色培養法用于定量檢測金黃色葡萄球菌更具有優勢。這與許多學者研究結果一致[12-14]。在實際檢測過程中采取何種方法應根據實驗室實際情況及檢測樣品的情況而定。

實驗室能力驗證是利用實驗室間比對來確定實驗室檢測能力的活動，是為確保實驗室維持較高檢測水平而對其能力進行的考核、監督和確認的一種驗證活動[15]。可客觀的反應實驗室的檢測水平；通過能力驗證，實驗室可以發現自身與其它實驗室檢測水平的差異，幫助實驗室發現問題并尋求解決問題的辦法；同時也是判定申請認可實驗室的能力和獲準認可實驗室維持其技術能力的重要依據之一[16]。在本次能力驗證中，兩個樣品都獲得滿意結果，且測定結果都與中位值比較接近。結合表2、表4，我們發現顯色培養法也能得到可靠的結果，且顯色培養法對金黃色葡萄球菌進行定量檢測，檢測時間短，選擇性強，因而在金黃色葡萄球菌的定量檢測中更具優勢。

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Proficiency Testing Results and Analysis of Quantitative Detection of Staphylococcus aureus

LU Qi-cong1，2，ZHONG Yu-si1，2，WANG Li-bo2，CHENG Xiao-qing1，2
（1.Chengdu Test Center，State Light Industry Food Quality Supervision and Detection Station，Chengdu 610081，Sichuan，China；2.Light Industry Research and Design Institute of Sichuan Province，Chengdu 610081，Sichuan，China）

According to the Baird-Parker plate count method and chromogenic medium，the proficiency testing was conducted for quantitative detection of Staphylococcus aureus.The results of quantitative detection of Staphylococcus aureus in sample 16-K717 was 173 000 CFU/mL and in sample 16-Y374 was 86 CFU/mL.The evaluation of two samples test results were given by the Chinese Academy of Inspection and Quarantine Comprehensive Inspection Center.Both of them were satisfactory as the Z score were 0.68，0.38 respectively.Compared with Baird-Parker plate count，chromogenic medium is more suitable for quantitative detection of Staphylococcus aureus.In general，this research provided certain support for the quantitative detection of Staphylococcus aureus.

Staphylococcus aureus；quantitative detection；proficiency testing

2016-12-09

陸其聰（1987—），女（漢），助理工程師，碩士，主要從事食品微生物檢測工作。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.034