RUNX2基因rs1406846位點多態性與中國漢族女性TMJOA的相關性研究

肖佳靈　高金星　程剛

[摘要] 目的 本研究旨在評價RUNX2基因rs1406846位點多態性與中國漢族女性顳下頜關節骨關節炎的相關性。方法 依據顳下頜關節紊亂病研究診斷標準（RDC/TMD），共納入240例受試者，包括114例TMJOA患者和126例健康的女性對照。運用測序的方法檢測RUNX2基因上rs1406846位點的多態性，并采用Logistic回歸模型對基因型、等位基因、攜帶頻率分布進行統計學分析（SPSS 20.0）。結果 中國漢族女性TMJOA組中攜帶RUNX2-rs1406846上TT基因型和對照組的AA基因型相比具有統計學差異（P=0.032），T等位基因頻率在TMJOA組中明顯高于健康對照組（64.0% vs 54.4%， P=0.032）。結論 單核苷酸多態性研究顯示，在中國漢族女性的TMJOA人群中RUNX2基因和TMJOA具有相關性，其中T等位基因可能是該疾病的危險因素。

[關鍵詞] 顳下頜關節；骨關節炎；單核苷酸多態性；RUNX2

[中圖分類號] R782.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）19-0001-04

[Abstract] Objective To evaluate the association between rs1406846 polymorphism of RUNX2 gene and temporomandibular joint osteoarthritis in Chinese Han females. Methods A total of 240 subjects， including 114 TMJOA patients and 126 healthy female controls were enrolled， according to the diagnostic criteria for temporomandibular disorders（RDC/TMD）. The polymorphism of rs1406846 locus of RUNX2 gene was detected by sequencing. And the genotype， allele and frequency distribution were analyzed by Logistic regression model（SPSS 20.0）. Results There was statistically significant difference between TT genotype of RUNX2-rs1406846 gene in the Chinese Han female TMJOA group and AA genotype in the control group（P=0.032）. T allele frequency was significantly higher in the TMJOA group than that in the healthy control group（64.0% vs 54.4%， P=0.032）. Conclusion The single nucleotide polymorphism study shows that there is correlation of RUNX2 gene and TMJOA in the TMJOA population of Han Chinese women， and the T allele might be the risk factor of the disease.

[Key words] Temporomandibular joint； Osteoarthritis； Single nucleotide polymorphism； RUNX2

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是以關節軟骨的進行性破壞和損耗為主要病理學特征，伴有軟骨下骨組織改建和滑膜相應病變的一種退行性疾病。該病發病隱匿，病程遷延，可導致功能障礙，嚴重影響患者的生活質量，臨床上尚缺乏有效的治療手段。目前認為OA是一種多基因參與的復雜性疾病，是由遺傳因素和環境因素共同作用所致，遺傳因素賦予患者疾病的易感性[1-3]。顳下頜關節（temporomandibular joint，TMJ）在頜面部的生長發育中起著重要作用，其結構和功能復雜，較易罹患骨關節炎。近年來，基因多態性與疾病易感性的分子流行病學研究迅速發展，作為第三代遺傳標記，單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）在基因組中具有密度高、保守、穩定和易于分型的優點，在疾病特別是多基因疾病發病中具有重要作用。RUNX2是骨和軟骨發育和分化重要的轉錄調控因子，并且在歐洲人群的全基因組關聯分析中發現RUNX2和大關節的骨關節炎存在潛在的相關性[4]。RUNX2上多態性位點rs1406846和股骨與脛骨的發育長度存在明顯的相關性，并且女性個體顯示出更強的遺傳相關性[5]。本研究通過DNA測序法對114例女性TMJOA患者和126例健康人進行檢測，通過對兩組人群進行比較，探討RUNX2-rs1406846多態性位點與中國漢族女性TMJOA之間的相關性，為骨關節炎發病中遺傳多態性的進一步研究提供相關依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2011年8月～2016年12月在本院口腔科就診的漢族女性患者。TMJOA的診斷標準依據RDC/TMD（Research Diagnostic Criteria for Temporomandibular Disorders）標準進行[6]。臨床診斷為顳下頜關節紊亂病，并行曲面體層、CBCT檢查，影像學上至少一側存在髁突磨平、硬化、骨質增生、破壞、囊樣變等表現而確診為OA的患者[7]（封三圖 1 A、B和C）。所有病例均為散發病例，無家族史，病例組（TMJOA組）年齡12～60歲，平均（33.59±14.31）歲。健康對照：選取同時段內在本院口腔頜面外科就診因正畸需要、阻生智齒需拔牙、修復需要行牙槽外科手術的患者以及部分院內職工和志愿者學生，全身情況良好，既往無顳下頜關節紊亂病及其他關節炎的病史，家族中亦無風濕、類風濕性關節炎及其他結締組織疾病史，曲面體層或CBCT檢查無明確OA者。對照組平均年齡（31.37±9.96）歲。病例組和對照組在年齡、性別等一般資料上具有可比性，所有患者均自愿參加本研究，入組前簽署知情同意書。

1.2 樣本收集

病例組與對照組均于空腹時一次性抽取外周靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，-80℃保存。血樣在24 h內進行處理、標記、登記、凍存。由專人負責將臨床資料、一般情況等數據錄入。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取 基因組DNA提取采用常規的酚/氯仿提取法提取基因組DNA，并溶于TE緩沖液中，獲得的基因組DNA用NanoDrop測OD值和濃度，-20℃保存備用。

1.3.2 引物 參照Gene Bank中RUNX2基因序列及相關文獻設計合成引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，上游引物：5′-AGCATGGCACCCAATCCTTTA-3′，下游引物：5′-GCAAGGCTGTTTCCGATGAG-3′。

1.3.3 PCR反應 PCR反應體系25 μL：DNA模板（40 ng/μL）1 μL，引物P1、P2各0.5 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，Taq DNA聚合酶（1U/μL）0.5 μL，滅菌三蒸水19.5 μL。擴增程序為：94℃預變性2 min后進行30個循環，每個循環為98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min。最后4℃保存。取PCR產物3 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.3.4 DNA測序 樣品采用DNA測序方法對單核苷酸多態性位點進行檢測分型，通過測序峰圖對SNP位點進行比對分型，所有測序工作均由華大基因公司完成（中國）。

1.4 統計學處理

采用軟件SPSS 20.0對多態性位點等位型、基因型和等位基因頻率、所有樣本的Hardy-Weinberg平衡檢驗進行統計分析，計數資料以百分比表示，組間兩兩比較用χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，多組間比較用Logistic回歸模型，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR結果

擴增出的目的片段大小為475 bp，基因組DNA和PCR產物電泳結果見封三圖 2。

2.2 測序峰圖

根據測序后單核苷酸多態性分型結果，RUNX2基因rs1406846多態性位點基因型為TT型、TA型以及AA型。RUNX2-rs1406846位點的測序分型如封三圖 3。

2.3 基因型和等位基因頻率

入組的樣本共240例，包括TMJOA組114例，健康對照組126例，均為中國漢族女性（具體入組樣本信息見表 1）。單核苷酸多態性位點-rs1406846的基因型和等位基因頻率滿足哈迪溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium），TMJOA組和健康對照組在年齡上沒有統計學差異[（33.59±14.31）歲 vs（31.37±9.96）歲，P=0.16]，排除年齡因素對分析結果的影響。

相關性檢測分析發現RUNX2基因的SNP位點-rs1406846和中國漢族女性TMJOA易感性具有相關性。RUNX2-rs1406846上的T等位基因頻率在TMJOA組明顯高于健康對照組（64.0% vs 54.4%，P=0.032），且其在TMJOA中TT基因型和對照組的AA基因型比較具有統計學差異（P=0.032），而攜帶雜合子TA基因型的相比于AA基因型攜帶者未顯著增加患TMJOA的風險（OR=1.71，95% CI：0.81～3.59，P=0.158）。見表 2。

3 討論

顳下頜關節骨關節炎（temporomandibular joint osteoarthritis， TMJOA）是口腔頜面部的一種常見病，與大關節OA有許多類似的表現，但又有其自身特點。由于下頜髁突是頜面部的生長發育中心，TMJOA不僅影響顳下頜關節的功能運動，而且會影響頜面部的正常發育，造成下頜骨發育不良、錯頜畸形等。因此，TMJOA不僅影響患者的生活質量，給患者帶來嚴重的經濟負擔，還可能造成患者的心理障礙。骨關節炎的發展隨著時間的推移逐漸加重并且早期癥狀往往不明顯，因此開發與疾病進程相適應的治療藥物十分困難。另一方面，對OA早期患者缺乏有效的可供篩查的生物標記和敏感的檢測技術，臨床上也難以及時采取有效的治療或干預措施。單核苷酸多態性具有分布廣泛、高度穩定、易于自動化分析等優點，其反映了人群的遺傳背景對疾病的易感性，是一種理想的生物學標志物。遺傳修飾改變的檢測對于疾病診斷、治療以及藥物研發具有重要的臨床意義和應用前景[3]。目前研究較多的OA易感基因有生長分化因子5、雌激素受體基因、鈣調蛋白基因-1、無孢蛋白基因、分泌型卷曲相關蛋白基因、白介素-1相關基因等[8，9]，但OA易感基因在不同性別、不同人種以及不同關節中有所差別，且其作用機制尚不明確，有待進一步研究。

RUNX2是轉錄因子RUNXX家族成員之一，作為一個具有多種功能的轉錄因子，具有調節肥大軟骨細胞中X型膠原、磷蛋白、涎蛋白和MMP13表達的能力，被認為是晚期軟骨細胞分化的關鍵調節分子[10-13]。為了維持軟骨細胞的正常形態，在小鼠TMJ和膝關節的軟骨表層細胞中，RUNX2的表達常常受到抑制[14]，而SMAD3本身可以通過促進Ⅱ型膠原的表達以及抑制RUNX2誘導的MMP13的表達，使軟骨細胞外基質的合成和分解保持平衡[15]。RUNX2基因敲除小鼠表現出嚴重的軟骨細胞分化延遲和軟骨內成骨缺陷，并且具有顯性抑制效應的RUNX2通過調控Ⅱ型膠原啟動子區使小鼠表現出類似的軟骨發育缺陷[16-18]。另一方面，RUNX2作為骨細胞的特異性轉錄因子，對骨組織的形成和重建也起著重要作用。RUNX2上多態性位點和骨骼的發育亦存在相關性，其上的SNP位點rs2819858、rs1406846、rs2819854和股骨和脛骨的長度存在明顯的相關性[5]。Grcevic D等[19]學者通過外周血表達譜檢測發現，RUNX2表達水平的改變可以作為類風濕性關節炎、OA等多種骨關節病中骨代謝水平的潛在標志物。Gelse K等[20]學者研究發現在人膝關節OA骨刺中對比正常關節軟骨，RUNX2 mRNA表達水平升高12.7倍。本研究發現RUNX2-rs1406846和中國漢族女性TMJOA具有相關性，該SNP位點位于RUNX2的內含子區域，其遺傳相關性可能通過和其他SNP位點連鎖不平衡或影響RUNX2的表達或下游蛋白的功能，具體功能有待于進一步研究。

隨著遺傳學與分子流行病學研究的迅速發展，SNPs與骨關節炎相關性的研究日漸深入，易感基因多態性的發現將有助于提高人們對OA發病機制的認識以及指導疾病的早期預防和治療。盡管目前已經發現了不少OA易感基因，并對其SNPs位點進行了較多研究，但是對于同一基因同一SNP在不同關節、不同種族、不同性別以及不同年齡的研究結果并不完全一致[21]。本研究發現在中國漢族女性人群中，RUNX2基因上rs1406846多態性位點和顳下頜關節骨關節炎易感性具有相關性，其中T等位基因可能是該疾病的危險因素。該研究結果僅代表該多態性位點在中國漢族女性TMJOA中的分布情況，樣本量較小，且未對其他種族和男性TMJOA人群進行相關性分析，以上結果為今后大樣本、多中心的TMJOA遺傳學研究提供初步的研究思路和實驗依據。

[參考文獻]

[1] Felson DT，Naimark A，Anderson J，et al. The prevalence of knee osteoarthritis in the elderly. The framingham osteoarthritis study[J]. Arthritis Rheum，1987，30（8）：914-918.

[2] Valdes AM，Spector TD. The clinical relevance of genetic susceptibility to osteoarthritis[J].Best Pract Res Clin Rheumatol， 2010，24（1）：3-14.

[3] MacGregor AJ，Antoniades L，Matson M，et al. The genetic contribution to radiographic hip osteoarthritis in women：Results of a classic twin study[J].Arthritis Rheum， 2000，43（11）：2410-2416.

[4] Arc OC，Zeggini E. Identification of new susceptibility loci for osteoarthritis（arcogen）：A genome-wide association study[J].Lancet 2012，380（9844）：815-823.

[5] Ermakov S，Malkin I，Kobyliansky E，et al. Variation in femoral length is associated with polymorphisms in runx2 gene[J].Bone 2006，38（2）：199-205.

[6] Schiffman E，Ohrbach R，Truelove E，et al. Diagnostic criteria for temporomandibular disorders（dc/tmd）for clinical and research applications：Recommendations of the international rdc/tmd consortium network and orofacial pain special interest groupdagger[J].J Oral Facial Pain Headache，2014， 28（1）：6-27.

[7] Dworkin SF，LeResche L. Research diagnostic criteria for temporomandibular disorders：Review，criteria，examin-ations and specifications，critique[J].J Craniomandib Disord， 1992，6（4）：301-355.

[8] Miyamoto Y，Mabuchi A，Shi D，et al. A functional polymorphism in the 5'UTR of GDF5 is associated with susceptibility to osteoarthritis[J].Nat Genet 2007，39（4）：529-533.

[9] Ushiyama T，Ueyama H，Inoue K，et al. Estrogen receptor gene polymorphism and generalized osteoarthritis[J].J Rheumatol，1998，25（1）：134-137.

[10] Komori T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by runx2[J].Cell Tissue Res，2010，339（1）： 189-195.

[11] Tetsunaga T，Nishida K，Furumatsu T，et al. Regulation of mechanical stress-induced mmp-13 and adamts-5 expression by runx-2 transcriptional factor in sw1353 chondrocyte-like cells[J].Osteoarthritis Cartilage，2011， 19（2）：222-232.

[12] Inada M，Wang Y，Byrne MH，et al. Critical roles for collagenase-3（mmp13）in development of growth plate cartilage and in endochondral ossification[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（49）：17192-17197.

[13] Fosang AJ，Last K，Knauper V，et al. Degradation of cartilage aggrecan by collagenase-3（mmp-13）[J].FEBS Lett，1996，380（1-2）：17-20.

[14] Kuboki T，Kanyama M，Nakanishi T，et al. Cbfa1/runx2 gene expression in articular chondrocytes of the mice temporomandibular and knee joints in vivo[J].Arch Oral Biol，2003，48（7）：519-525.

[15] Chen CG，Thuillier D，Chin EN，et al. Chondrocyte-intrinsic smad3 represses runx2-inducible matrix metalloproteinase 13 expression to maintain articular cartilage and prevent osteoarthritis[J].Arthritis Rheum，2012，64（10）：3278-3289.

[16] Ueta C，Iwamoto M，Kanatani N，et al. Skeletal malformations caused by overexpression of cbfa1 or its dominant negative form in chondrocytes[J].J Cell Biol，2001， 153（1）：87-100.

[17] Fujita T，Azuma Y，Fukuyama R，et al. Runx2 induces osteoblast and chondrocyte differentiation and enhances their migration by coupling with pi3k-akt signaling[J].J Cell Biol，2004，166（1）： 85-95.

[18] Inada M，Yasui T，Nomura S，et al.Maturational distur-bance of chondrocytes in cbfa1-deficient mice[J].Dev Dyn，1999，214（4）： 279-290.

[19] Grcevic D，Jajic Z，Kovacic N，et al. Peripheral blood expression profiles of bone morphogenetic proteins tumor necrosis factor-superfamily molecules，and transcription factor runx2 could be used as markers of the form of arthritis，disease activity，and therapeutic responsiveness[J].J Rheumatol，2010，37（2）： 246-256.

[20] Gelse K，Ekici AB，Cipa F，et al. Molecular differentiation between osteophytic and articular cartilageclues for a transient and permanent chondrocyte phenotype[J].Osteoarthritis Cartilage，2012，20（2）：162-171.

[21] Reynard LN，Loughlin J. Insights from human genetic studies into the pathways involved in osteoarthritis[J].Nat Rev Rheumatol，2013，9（10）：573-583.

（收稿日期：2017-05-08）