西洋參莖葉皂苷對大鼠局灶性腦缺血損傷炎癥反應的影響

任鵬宇　關亞新　張婷婷

[摘要] 目的 探討西洋參莖葉皂苷（PQS）對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用與炎癥反應之間的關系。方法 SD大鼠120只，隨機分為5組，對照組、模型組、西洋參莖葉皂苷（50、100、200 mg/kg）組，采用大腦中動脈阻塞法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。缺血再灌24 h后檢測大鼠神經功能損傷評分；干濕重法測定腦含水量；生化法檢測腦組織髓過氧物酶（MPO）的活性；ELISA 法檢測大鼠腦組織及血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）的含量。結果 西洋參莖葉皂苷（100、200 mg/kg）組可明顯減輕缺血再灌注大鼠腦神經功能損傷和腦水腫程度，降低缺血腦組織MPO的活性，降低缺血腦組織和血清TNF-α和IL-6的含量。結論 西洋參莖葉皂苷可通過降低TNF-α 和IL-6炎性細胞因子的表達，減緩炎癥反應，減輕腦水腫，降低大鼠腦神經功能損傷程度，進而對腦缺血再灌注損傷起到一定的保護作用。

[關鍵詞] 缺血再灌注；西洋參莖葉皂苷；炎癥；腫瘤壞死因子α

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）19-0033-03

[Abstract] Objective To explore the relationship between the protective effect of panax quinquefolium saponins （PQS） on focal cerebral ischemic injury in rats and the inflammatory reactions. Methods 120 SD rats were randomly divided into 5 groups，control group， model group， PQS groups（50， 100， 200 mg/kg）. A model of cerebral ischemia-reperfusion injury was established by middle cerebral artery occlusion. The score of rats' neurological impairment was measured 24 hours after ischemia reperfusion； brain water content was measured by dry and wet weight method； the activity of myeloperoxidase（MPO） in brain tissue was detected by biochemical method. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in rats' brain tissues and serum were measured by ELISA. Results PQS （100， 200 mg/kg） could significantly reduce the degree of cerebral nerve impairment and cerebral edema in the rats with ischemia-reperfusion injury， decrease the activity of MPO in ischemic brain tissue， and lower the contents of TNF-α and IL-6 in ischemic brain tissue and serum. Conclusion Panax quinquefolium saponins（PQS） can slow the inflammatory reactions， alleviate cerebral edema and reduce the degree of neurological impairment in rats by decreasing the expression of TNF-α and IL-6 inflammatory cytokines， and then exert a protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury.

[Key words] Ischemia reperfusion； Panax quinquefolium saponins （PQS）； Inflammations； Tumor necrosis factor-α

西洋參莖葉皂苷（PQS）是由西洋參莖和葉中所提取的主要活性成分，具有增強免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗心肌缺血損傷等廣泛的生物活性[1]。近年研究發現[2-3]，PQS對腦缺血損傷具有保護作用，但具體機制仍未完全明確，尤其是其關于抗炎機制的報道相對較少。因此，本實驗采用大腦中動脈阻塞法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察PQS對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用，研究其保護作用機制與炎癥反應之間的相互關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大鼠50只，清潔級，雄性，體重280～330 g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK（京）2012-0001]。所有大鼠給予常規飼料飼養，自由飲水和攝食，保持室內安靜，日照12 h，室溫保持在 20℃～25℃，相對濕度控制在40%～60%。

1.2 藥品與試劑

西洋參莖葉皂苷由吉林大學基礎醫學院有機化學教研室提供，純度>90%；TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒均由欣博盛生物科技有限公司提供。

1.3 給藥與分組

SD大鼠按體重隨機被分為以下5組：（1）對照組；（2）缺血再灌注模型組；（3）PQS治療組（50、100、200 mg/kg）組，每組10只。PQS治療組于模型制備前每天灌胃給藥1次，連續灌胃7 d。對照組和模型組均灌胃給予相同容積的生理鹽水。

1.4 采用 Longa 線栓法[4]加以改進制備大腦中動脈缺血再灌注損傷模型

大鼠以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉后，固定于手術臺，頸部采用左旁中切口，暴露左側頸總（CCA）、頸內動脈（ICA）和頸外動脈（ECA），并鈍性分離，ECA結扎后于其分叉處剪一0.2 mm切口，將直徑為0.245 mm、頭端制成直徑約為0.34 mm光滑圓球的尼龍線自切口處經頸內、頸外動脈分叉部進入頸內動脈，遇輕微阻力時停止推入，插入深度約為17～20 mm，扎緊并固定線栓，缺血2 h提拉栓線至頸總動脈內進行再灌注。術后以電熱毯保暖使大鼠直腸體溫維持在（37±0.5）℃。對照組僅分離血管，并把尼龍線插入頸總動脈1 cm左右，不達到大腦中動脈位置。

1.5 神經功能損傷評分

動物蘇醒后放回籠內，自由飲食，腦缺血再灌注24 h后根據Longa的5分法對大鼠進行神經功能障礙評分。0分：無神經功能障礙；1分：右前爪不能充分外展；2分：行走時朝右轉圈；3分：行走時朝右傾倒；4分：不能自主行走，伴意識障礙[5]。選取神經功能損傷評分為1～3分大鼠用于以下實驗，每組各6只。

1.6 干濕重法行腦含水量測定

缺血再灌注24 h后，大鼠迅速斷頭取腦。用濾紙吸除缺血側腦皮質表面的殘血，電子天平精確稱其濕重，然后將腦組織置于105℃常壓恒溫烘箱中，烘烤至恒重水平，電子天平精確稱其干重。采用如下公式：腦組織含水量（%）=（腦組織濕重-腦組織干重）/腦組織濕重×100%，計算腦組織含水量。

1.7 腦組織髓過氧化物酶（MPO）活性測定

各組大鼠在缺血再灌注24 h后，迅速斷頭，取大鼠缺血側額頂葉皮層腦組織100 mg，用試劑盒提供的介質溶液將大鼠腦組織制成 10%的勻漿液，嚴格按照檢測試劑盒說明書步驟進行操作，計算腦組織MPO活性。

1.8 腦組織及血清TNF-α和IL-6含量測定

各組大鼠在缺血再灌注24 h后，心臟取血3～5 mL，于4℃ 2000 r/min條件下離心10 min，取血清并放置于-80℃冰箱保存；各組大鼠在缺血再灌注24 h后迅速斷頭，用加冰生理鹽水將缺血側皮層腦組織制成10%的勻漿液，于4℃條件下離心10 min，吸取上清保存于-80℃冰箱；按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測腦組織及血清樣品中TNF-α和IL-6的含量。

1.9 統計學處理

結果采用 SPSS 17.0 統計學軟件分析處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間資料統計采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PQS對腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能障礙的影響

對照組大鼠無神經功能損傷障礙表現；腦缺血再灌注24 h 后，模型組大鼠均表現出不同程度的神經功能缺損癥狀，相比對照組，模型組大鼠神經功能損傷評分明顯增高（P<0.01），提示造模成功；與模型組相比，PQS（100、200 mg/kg）劑量組可明顯降低大鼠神經功能損傷評分（P<0.05）。見表1。

2.2 PQS對缺血腦組織含水量的影響

與對照組比較，模型組大鼠缺血腦組織含水量明顯增高，差異具有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，PQS高劑量組可明顯降低大鼠腦組織含水量，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 PQS對缺血腦組織MPO活性的影響

模型組大鼠缺血腦組織中MPO 活性明顯高于對照組（P<0.01）；PQS（100、200 mg/kg）劑量組可明顯降低缺血腦組織MPO活性，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.4 PQS對缺血腦組織TNF-α和IL-6含量的影響

模型組大鼠腦組織TNF-α和IL-6的含量較對照組均明顯升高（P<0.01，P<0.05）；相比模型組，PQS（100、200 mg/kg）劑量組均可明顯降低缺血腦組織TNF-α和IL-6的含量，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.5 PQS對大鼠血清TNF-α和IL-6含量的影響

模型組大鼠血清TNF-α和IL-6的含量較對照組均明顯升高 （P<0.01）；相比模型組，PQS（100、200 mg/kg）劑量組均可明顯降低血清TNF-α和IL-6的含量，差異具有顯著性（P<0.05）。見表3。

3 討論

既往研究提示在缺血再灌注腦損傷的生理病理發展過程中炎癥反應起著非常重要的作用[6-7]。缺血再灌注發生后，神經膠質細胞、中性粒細胞等炎性細胞被激活，血腦屏障由于內皮細胞炎癥反應而受到損傷，從而引發腦水腫，形成缺血與炎性反應之間的惡性循環。腦缺血后釋放多種炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素 6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）、白介素10（IL-10）等均參與以上病理生理學反應過程，從而促進腦缺血性損傷向炎癥性損傷發生轉變[8-9]。實驗研究發現，阻斷腦缺血再灌注引發的炎癥應答過程對腦組織具有一定的保護作用[10-11]。因此，通過抑制炎癥反應、減輕神經細胞的損傷可成為防治腦缺血再灌注損傷的一個重要策略。

本實驗采用大鼠局灶性缺血再灌注腦損傷模型模擬臨床腦缺血損傷病理變化，觀察發現PQS可減輕腦缺血再灌注大鼠神經功能損傷、抑制腦水腫，這與以往研究結果一致[12]，提示PQS對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定程度的保護作用。此外，研究發現，PQS（100、200 mg/kg）劑量組可明顯降低缺血腦組織MPO活性（P<0.05）。位于中性粒細胞嗜天青顆粒中的MPO，可作為中性粒細胞的特異性標記物，其活性可評價中性粒細胞在組織中的浸潤程度及組織炎癥反應的程度[13-14]。本研究觀察結果提示PQS可減輕由腦缺血再灌注損傷所誘導的炎癥反應。

TNF-α主要由活化的單核巨噬細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞和神經元分泌產生，是體內最為重要的炎癥介質之一。研究表明在腦缺血早期即出現TNF-α表達水平上調高，其可激活炎性細胞、誘導IL-6、IL-1β等多種細胞因子的表達，從而促進神經細胞的凋亡、壞死和腦水腫的形成，TNF-α在腦缺血早期分泌或合成的增加是腦梗死形成的主要原因[15-16]。IL-6在腦缺血損傷中的作用機制復雜，具有保護和損傷雙重作用。IL-6在正常生理狀態下，其血清表達水平很低，具有保護和修復神經元的作用；IL-6在腦缺血后的急性損傷期，其表達量迅速升高，可導致神經元的破壞及內皮細胞、膠質細胞的損傷。IL-6作為缺血性腦損傷急性期嚴重程度的重要標志，可受TNF-α、IL-1β的調控，進而參與機體的炎癥和免疫反應[17-18]。因此，抑制炎性因子TNF-α、IL-6等的合成、分泌及表達，減輕神經細胞缺血性損傷可成為減輕缺血再灌注腦損傷的一項重要策略。在本研究結果中TNF-α和IL-6在對照組大鼠血清和腦組織中的含量均較低，而模型組大鼠血清和腦組織中TNF-α和IL-6的含量均顯著升高，且TNF-α與IL-6的含量變化趨勢基本一致，也提示二者在腦組織發生缺血再灌注損傷后具有協同作用。PQS（100、200 mg/kg）劑量組均可明顯降低缺血再灌注損傷后大鼠血清和腦組織中TNF-α和IL-6的含量，提示PQS可通過抑制炎性細胞因子減輕炎癥反應，進而減輕缺血性腦損傷。

綜上所述，PQS可通過調節炎癥性細胞因子TNF-α和IL-6的合成及分泌，減緩炎性反應，抑制腦水腫，減輕缺血大腦神經功能損傷程度，進而對大鼠缺血再灌注腦損傷產生保護作用。

[參考文獻]

[1] 薛燕，聞莉.西洋參根及莖葉皂苷提取物中12種主要皂苷成分的分析研究[J].藥物分析雜志，2009，29（1）：79-81.

[2] 關利新，翟鳳國，聶影，等.西洋參莖葉皂苷對腦缺血大鼠細胞凋亡及caspase-3表達的影響[J].中藥藥理與臨床，2008，24（1）：30-32.

[3] 王懷剛，關利新，趙鑫，等.西洋參莖葉皂苷對局灶性腦缺血后大鼠血清中GFAP 表達的影響[J].中醫藥學報，2011，4（39）：17-19.

[4] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91.