1—甲基乙內(nèi)酰脲與氟尿嘧啶聯(lián)合對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡作用的研究

許云吉　梁慶模

[摘要] 目的 探討1-甲基乙內(nèi)酰脲（1-methylhydantoin）單用以及與氟尿嘧啶（5-Fu）聯(lián)合對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖抑制作用和誘導(dǎo)凋亡。 方法 使用MTT比色法檢測(cè)1-甲基乙內(nèi)酰脲M（a-h）在不同濃度（0.5、5、10、20、50、100、200、500 mg/L）單用及與不同濃度5-Fu（a-d）（10、20、50、100 mg/L）聯(lián)合作用于人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的吸光度值，然后再計(jì)算抑制率（IR）。流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)Md、Me、Fub、Md+Fub、Me+Fub處理SW480細(xì)胞48 h對(duì)細(xì)胞周期分布和凋亡影響。 結(jié)果 1-甲基乙內(nèi)酰脲在體外對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞有增殖抑制作用。在低濃度時(shí)，1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖抑制效果與5-Fu相當(dāng)（P>0.05）；在高濃度時(shí)，1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞抑制增殖效果弱于5-Fu（P<0.05）。1-甲基乙內(nèi)酰脲與氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同抗腫瘤效果。 結(jié)論 1-甲基乙內(nèi)酰脲能夠抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，并與氟尿嘧啶有協(xié)同抗瘤細(xì)胞增殖效果。

[關(guān)鍵詞] 1-甲基乙內(nèi)酰脲；結(jié)腸癌；MTT比色法；氟尿嘧啶；增殖抑制；誘導(dǎo)凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）19-0036-04

[Abstract] Objective To investigate the proliferation inhibitory effect and inducingapoptosis of 1-methylhydantoin alone and combined application with 5-fluorouracil（5-Fu） on human colon cancer SW480 cells. Methods MTT colorimetric assay was used to detect the absorbance value of colon cancer SW480 cells after the application of different concentrations of 1-methylhydantoin（0.5， 5， 10， 20， 50， 100， 200， 500 mg/L） alone and combined application with 5-Fu（10， 20， 50， 100 mg/L）， and then the inhibitory rate was calculated.Flow cytometry was used to monitor the cell cycle distribution and apoptosis of SW480 cells treated with Md， Me， Fub， Md+Fub and Me+Fub for 48 h. Results 1-methylhydantoin had an inhibitory effect on the proliferation of human colon cancer SW480 cells in vitro. At low concentration， the inhibitory effect of 1-methylhydantoin on the proliferation of human colon cancer SW480 cells was similar to that of 5-Fu（P>0.05）； at high concentration， the inhibitory effect of 1-methylhydantoin on the proliferation of human colon cancer SW480 cells was weaker than that of 5-Fu（P<0.05）. Combined application of 1-methylhydantoin and 5-Fu had a synergistic anti-tumor effect. Conclusion 1-methylhydantoin can inhibit the proliferation and inducingapoptosis of human colon cancer cell SW480 and has a synergistic effect with 5-Fu.

[Key words] 1-methylhydantoin； Colon cancer； MTT colorimetric assay； Fluorouracil； Proliferation inhibition； Inducingapoptosis

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生存健康，結(jié)腸癌就是其中之一，是僅次于乳腺癌、肺癌的惡性腫瘤。隨著經(jīng)濟(jì)逐步發(fā)展，生活及精神壓力不斷增加，生活節(jié)奏日益加快，生活習(xí)慣改變，人口老齡化逐步加劇，飲食及膳食結(jié)構(gòu)的變化，我國(guó)結(jié)腸癌患者的死亡率及患病率逐年遞增。在臨床治療中，積極開(kāi)發(fā)新的抗惡性腫瘤治療藥物及治療手段意義深遠(yuǎn)。獨(dú)角蓮為我國(guó)獨(dú)有的一味中草藥，它具有抗驚厥、抗炎、抗破傷風(fēng)毒素、調(diào)節(jié)免疫、抑制酪氨酸酶、殺菌、祛痰、增強(qiáng)免疫力等藥理作用，近年來(lái)在抗腫瘤藥物的研究中發(fā)現(xiàn)，獨(dú)角蓮及其提取物對(duì)乳腺癌、胃癌、原發(fā)性肝癌、肺癌等多種癌細(xì)胞具有增殖抑制效果[1-3]。1-甲基乙內(nèi)酰脲是從獨(dú)角蓮中提取得到的[4]，研究證實(shí)，它具有良好的抗炎效果，是治療免疫性疾病、炎癥的有效活性成分，另外，1-甲基乙內(nèi)酰脲還能抑制活化的淋巴細(xì)胞破壞內(nèi)皮細(xì)胞、消除羥基自由基活性[5-6]。然而，1-甲基乙內(nèi)酰脲抑制惡性細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用的相關(guān)報(bào)道較少。本文旨在探討1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì)體外培養(yǎng)的SW480細(xì)胞增殖是否有抑制作用，以及對(duì)SW480細(xì)胞凋亡是否有誘導(dǎo)作用，同時(shí)與氟尿嘧啶的增殖抑制作用強(qiáng)弱相比較，以期為臨床開(kāi)發(fā)新的藥物來(lái)治療結(jié)腸癌。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院）；二甲基亞砜（DMSO）、RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT粉、胰蛋白酶粉均購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司；1-甲基乙內(nèi)酰脲（分子式C4H6N2O2，純度>99.0%，分子量114.10）、5-氟尿嘧啶（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H31020593）；新生小牛血清（杭州四季清公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SW480細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基（含有10%的新生小牛血清）培養(yǎng)在5% CO2、37.0℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞單層附壁生長(zhǎng)，每2～3天傳代一次，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)資料[1-7]將實(shí)驗(yàn)分四組：1-甲基乙內(nèi)酰脲組M（a-h）、Fu（a-d）組、對(duì)照組、1-甲基乙內(nèi)酰脲和氟尿嘧啶聯(lián)合組。對(duì)照組：加入培養(yǎng)基、SW480細(xì)胞、用生理鹽水處理；乙內(nèi)酰脲組（干預(yù)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞24 h、48 h、72 h）：濃度M（a-h）分別為0.5、5、10、20、50、100、200、500 mg/L；氟尿嘧啶組（干預(yù)48 h）：濃度Fu（a-d）分別為10、20、50、100 mg/L；聯(lián)合組（干預(yù)48 h）：濃度分別為Fua+Mc、Fub+Md、Fuc+Me、Fud+Mf。MTT比色法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株的抑制增殖效果，同時(shí)與單獨(dú)使用氟尿嘧啶作用效果進(jìn)行比較。Md、Me、Fub、Md+Fub、Me+Fub組干預(yù)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞48 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布及凋亡率。

1.2.3 MTT比色法測(cè)定SW480細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的SW480細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；用0.25%胰蛋白酶消化液消化后制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔細(xì)胞5200個(gè)接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)各組設(shè)置6個(gè)平行孔，培養(yǎng)至方案既定時(shí)間，用移液槍往培養(yǎng)板每孔中加20 μL 5 mg/L的噻唑氮藍(lán)液，再培養(yǎng)4 h后終止細(xì)胞培養(yǎng)，將96孔培養(yǎng)板每孔內(nèi)上清培養(yǎng)液用移液槍小心移除，用移液槍往每孔加150 μL二甲基亞砜，然后放在搖晃床上振蕩10 min，使充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在570 nm下吸光度值（0D值）。細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡率 按照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》書(shū)中所述流式細(xì)胞技術(shù)方法稍加改動(dòng)。將試驗(yàn)用細(xì)胞分別加入35 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶20 mL細(xì)胞混懸液，按照實(shí)驗(yàn)制定計(jì)劃加藥處理48 h，對(duì)照組加入等量PBS，在北京康為世紀(jì)生物科技有限公司上機(jī)檢測(cè)分析：所得數(shù)據(jù)采用Mod Fit LT for Mac V3.0軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，One Way ANOVA方式分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)方差，多組間均數(shù)采用SNK法進(jìn)行比較，組間比較采用Students t檢驗(yàn)，兩組計(jì)量資料比較采用LSD法，以上步驟重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì)SW480細(xì)胞增殖抑制率的影響

見(jiàn)表1。1-甲基乙內(nèi)酰脲在濃度5～500 mg/L濃度范圍對(duì)體外培養(yǎng)的SW480 細(xì)胞株具有抑制增殖作用，兩組比較差異顯著（P<0.05）。1-甲基乙內(nèi)酰脲在5～500 mg/L濃度范圍內(nèi)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制率有濃度依賴(lài)性，1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖抑制率在5～500 mg/L范圍內(nèi)遞增。1-甲基乙內(nèi)酰脲作用48 h后抑制SW480細(xì)胞增殖作用最顯著。

2.2 氟尿嘧啶、1-甲基乙內(nèi)酰脲分別對(duì)SW480細(xì)胞株增殖抑制率的影響

見(jiàn)表2。濃度為10、20 mg/L的1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用與等濃度氟尿嘧啶抑制效果相比，兩者對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖抑制效果相當(dāng)，無(wú)顯著性差異（P>0.05）。濃度為50、100 mg/L的1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株的抑制作用與濃度為50、100 mg/L的氟尿嘧啶抑制作用相比，氟尿嘧啶對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖抑制作用大于1-甲基乙內(nèi)酰脲，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用48 h對(duì)SW480細(xì)胞增殖抑制影響

見(jiàn)表3。與對(duì)照組對(duì)比，濃度在10～50 mg/L范圍內(nèi)氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SW480細(xì)胞增殖抑制率有濃度遞增趨勢(shì)，隨濃度增高聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制效果越明顯，組間兩兩對(duì)比具有顯著性差異（P<0.05）。濃度在100 mg/L時(shí)氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖抑制作用，與濃度為50 mg/L的氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖抑制作用相比效果相當(dāng)，無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

2.4 氟尿嘧啶+1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用與氟尿嘧啶單用對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的抑制作用

見(jiàn)表4。氟尿嘧啶與1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用對(duì)SW480細(xì)胞增殖抑制作用強(qiáng)于相同濃度氟尿嘧啶單用，具有顯著性差異（P<0.05）。氟尿嘧啶10 mg/L與1-甲基乙內(nèi)酰脲10 mg/L聯(lián)用組對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖抑制作用與氟尿嘧啶20 mg/L單用效果相當(dāng)，差異無(wú)顯著性 （P>0.05）。5-Fu 50 mg/L與1-甲基乙內(nèi)酰脲50 mg/L聯(lián)用對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的抑制效果強(qiáng)于氟尿嘧啶100 mg/L單獨(dú)作用，具有顯著性差異（P<0.05）。

2.5 1-甲基乙內(nèi)酰脲、氟尿嘧啶對(duì)SW480細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡影響

隨著濃度增高1-甲基乙內(nèi)酰脲單用及與氟尿嘧啶聯(lián)用使SW480細(xì)胞凋亡率逐漸上升，S期在細(xì)胞周期分布中所占百分比增大，兩組間比較有顯著性差異（P<0.05）。聯(lián)合組干預(yù)SW480細(xì)胞凋亡率所占百分比較單獨(dú)用藥組高，聯(lián)合組S期在細(xì)胞周期分布中所占百分比要比單獨(dú)用藥組高，兩組間比較有顯著性差異（P<0.05）。見(jiàn)表5。

3 討論

獨(dú)角蓮中提取物種類(lèi)眾多，1-甲基乙內(nèi)酰脲就是其中一種。研究證實(shí)，1-甲基乙內(nèi)酰脲具有廣闊的臨床應(yīng)用價(jià)值，風(fēng)濕免疫性疾病、缺血再灌注、肺纖維化等多種疾病[8-9]治療常用到1-甲基乙內(nèi)酰脲，然而1-甲基乙內(nèi)酰脲是否能抑制惡性腫瘤增殖以及是否能誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡？迄今為止相關(guān)報(bào)道及研究較少。因此我們課題組推測(cè)在結(jié)腸癌抗癌治療過(guò)程中使用1-甲基乙內(nèi)酰脲有效果。

本文在體外采用MTT 比色法檢測(cè)1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì)體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制作用。結(jié)果顯示，1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì)體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞具有增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，且結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率呈劑量依賴(lài)趨勢(shì)，結(jié)果與獨(dú)角蓮及其提取物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的報(bào)道[2]相符合。但其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用機(jī)制與腫瘤細(xì)胞的抑制效率、藥物劑量、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)對(duì)象等很多因素有關(guān)系，仍然需進(jìn)一步研究探討。

抗腫瘤藥物作用的強(qiáng)弱常以傳統(tǒng)藥物氟尿嘧啶作為對(duì)照。1-甲基乙內(nèi)酰脲對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖有抑制作用以及1-甲基乙內(nèi)酰脲可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。但和傳統(tǒng)化療藥物相比，1-甲基乙內(nèi)酰脲抗腫瘤作用效果如何？本研究選取同等劑量氟尿嘧啶作為參照，結(jié)果表明，1-甲基乙內(nèi)酰脲在低濃度時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)的SW480細(xì)胞抑制作用與氟尿嘧啶大致相等。1-甲基乙內(nèi)酰脲在高濃度時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)的SW480細(xì)胞抑制作用弱于氟尿嘧啶。本實(shí)驗(yàn)研究所得結(jié)果與獨(dú)角蓮醇提物在低濃度時(shí)抗惡性腫瘤增殖作用與氟尿嘧啶相比無(wú)顯著性差異、獨(dú)角蓮醇提物在高濃度時(shí)抗惡性腫瘤增殖作用要弱于氟尿嘧啶的報(bào)道相符合[10-11]。所以1-甲基乙內(nèi)酰脲具有非常好的抗惡性腫瘤價(jià)值，有必要進(jìn)一步探討研究。

抗癌藥物單獨(dú)使用容易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，且用藥過(guò)程中具有較大的細(xì)胞毒副作用，為了增強(qiáng)抗腫瘤藥物的效果，降低化療藥物的毒副作用以及避免腫瘤產(chǎn)生耐藥性，臨床上常使用多種藥物聯(lián)合抗癌治療。氟尿嘧啶是臨床上常用的抗癌藥，在抗癌治療過(guò)程中氟尿嘧啶常與其他抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用，不但可以降低惡性腫瘤產(chǎn)生耐藥性，還能增強(qiáng)抗癌藥物的臨床效果。1-甲基乙內(nèi)酰脲具有良好的抗惡性腫瘤作用已被本試驗(yàn)研究證實(shí)，同時(shí)將氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用的抗腫瘤作用與氟尿嘧啶單用進(jìn)行比較。研究結(jié)果表明，氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用抑制惡性腫瘤增殖作用要強(qiáng)于氟尿嘧啶單獨(dú)使用。值得一提的是，氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用抑制SW480細(xì)胞的增殖作用強(qiáng)于等濃度氟尿嘧啶單用，說(shuō)明二者聯(lián)合使用具有協(xié)同抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用?？拱┧幬锫?lián)合使用可以降低藥物毒副作用，此結(jié)果與獨(dú)角蓮及其提取物抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖的研究報(bào)道相符[12-15]。因此需要進(jìn)一步研究1-甲基乙內(nèi)酰脲與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用的臨床價(jià)值。

本研究為1-甲基乙內(nèi)酰脲單用及與傳統(tǒng)抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤治療提供了理論支持。但是1-甲基乙內(nèi)酰脲抗惡性腫瘤細(xì)胞增殖作用研究目前還處于體外研究階段，有必要開(kāi)展移植瘤動(dòng)物模型研究，為1-甲基乙內(nèi)酰脲進(jìn)入臨床抗癌治療奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-05-02）