草魚TRIM32基因克隆表達及功能研究

賈路路曾令兵王 方彭俊杰王業大周 勇劉學芹

(1.華中農業大學水產學院水生動物醫學系, 武漢 430070; 2.中國水產科學研究院長江水產研究所, 武漢 430070; 3.淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心, 武漢 430070; 4.池塘健康養殖湖北省工程實驗室, 武漢 430070)

草魚TRIM32基因克隆表達及功能研究

賈路路1,2,3,4曾令兵2王 方1,3,4彭俊杰1,3,4王業大1,3,4周 勇2劉學芹1,3,4

(1.華中農業大學水產學院水生動物醫學系, 武漢 430070; 2.中國水產科學研究院長江水產研究所, 武漢 430070; 3.淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心, 武漢 430070; 4.池塘健康養殖湖北省工程實驗室, 武漢 430070)

TRIM (Tripartite-motif protein) 家族是機體先天性免疫的重要成員, 參與細胞增殖分化、細胞凋亡、腫瘤抑制、抗病毒等過程。為了進一步探究TRIM蛋白在魚類免疫中的作用, 實驗利用PCR方法克隆了草魚TRIM32基因的編碼區全長, 共1980 bp, 編碼660個氨基酸。草魚TRIM32具有TRIM家族典型的3個結構域, 與斑馬魚TRIM32的核苷酸序列同源性較高, 遺傳進化分析也聚為一支。間接免疫熒光、Western-blotting檢測結果顯示草魚TRIM32在EPC細胞中成功表達, 主要以點狀分布在細胞質中, 細胞核中表達量較少; 組織分布分析表明TRIM32在被檢測的11個組織中均有表達, 其中在頭腎組織中的表達量明顯高于其他組織; 不同胚胎發育時期的表達分析進一步表明, TRIM32在受精卵時期、卵裂期和囊胚期的表達量顯著高于其他時期(P<0.05), 隨后表達量下降, 直到出膜后表達量再次顯著性升高。此外, 雙熒光素酶檢測系統顯示TRIM32能夠激活NF-κB信號通路, 誘導下游的炎癥反應。結果顯示, 草魚TRIM32廣泛分布于魚體內, 并參與機體的天然免疫反應, 對于抵抗病原體的入侵具有重要作用。

TRIM32; 克隆; 真核表達; NF-κB

TRIM (Tripartite-motif protein)家族蛋白, 也稱為RBCC家族蛋白, 從N端到C端依次是RING結構域、B-box結構域、Coiled-coil結構域, 其在細胞的增殖、分化、腫瘤的抑制、病毒的抑制等方面發揮了重要的調控作用[1,2]。在哺乳動物中TRIM家族的部分成員, 例如TRIM25、TRIM5α等, 在病毒感染宿主細胞的過程中可以起到E3泛素連接酶的作用, 從而調控機體的抗病毒天然免疫反應[3—6]。

在哺乳動物中TRIM32的功能研究較多, TRIM32 RING結構域具有泛素連接酶活性, 能夠促進下游靶蛋白發生泛素化修飾, 從而激活NF-κB信號通路; TRIM32還可以抑制病毒在宿主細胞內的表達, 促進病毒粒子的釋放[7—10]。此外, TRIM32 羧基末端含有6個NHL重復結構域(NCL-1、HT2A和LIN-41), 參與蛋白/蛋白相互作用[11]。在皮膚癌變模型小鼠以及UVB輻射誘發小鼠皮膚癌變的致癌性研究過程中發現, TRIM32的表達有顯著性升高,同時研究還發現TRIM32具有抗凋亡活性[12,13]。目前對于TRIM家族在魚類中的功能研究相對較少,主要集中在TRIM家族在魚類先天性免疫中的重要作用[14]。有研究表明魚類中TRIM家族同哺乳動物具有相似的功能, 在病毒刺激后魚體中TRIM家族的表達量上升, 同時也證實TRIM家族參與魚體的抗病毒天然免疫反應并發揮重要作用[15,16]。

本研究克隆表達了草魚 (Ctenopharyngodon idellus)TRIM32, 分析其在不同組織及不同胚胎發育時期的表達豐度, 并檢測對NF-κB信號通路的影響, 為研究草魚TRIM32在天然免疫中的作用及機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒、菌株及細胞組織載體質粒pcDNA 4.0和EPC細胞均由本實驗室保存, E.coli.DH5α感受態細胞購自TaKaRa公司, 草魚購自華中農業大學菜市場。

工具酶及化學試劑限制酶、T4 DNA連接酶、反轉錄試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司, 質粒DNA小提試劑盒購自Omega公司, HRPDAB底物顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司, 轉染試劑lipo2000購自Promega公司, 鼠源抗His標簽抗體購自Sigma公司, HRP標記的羊抗鼠熒光二抗購自美國Invitrogen公司, pNF-κB-Luc購自Agilent Technologies公司、pRL-TK購自Promega公司, M199培養基購自Hyclone公司, 新生胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 引物的設計

根據NCBI鯉TRIM32編碼區全長序列(序列號: emb|LN591166.1|), 用Primer5.0軟件設計擴增引物,上游引物為F: 5′-ATGGCCACACCAACATCCC TA-3′, 下游引物為R: 5′-TTAACATGTAGAGGA ACGTCTCT-3′。

設計真核表達引物, 上游引物加入BamHⅠ酶切位點, 下游引物加入XbaⅠ酶切位點, 上游引物為F1: 5′-AAAGGATCCATGGCCACACCAACATC CCTA-3′, 下游引物為R1: 5′-AAATCTAGAACAT GTAGAGGAACGTCTCT-3′, 下劃線部分為限制性內切酶位點。

設計熒光定量特異性引物, 上游引物RT-F: 5′-TGCCTTTGCCACCTCCTTG-3′, 下游引物RT-R: 5′-TCTTCTTCATTGTTACTCCCTTCC-3′。

以上引物均由武漢擎科新業生物技術有限公司合成。

1.3 TRIM32基因克隆

試驗草魚在實驗室暫養1周后, 冰上解剖取脾臟組織50—100 mg于1 mL Trizol試劑中, 按照Trizol使用說明提取總RNA, 以其反轉錄獲取的cDNA為模板, 通過PCR擴增TRIM32基因。PCR擴增程序為: 95℃預變性5min; 95℃變性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸2min, 共35個循環; 72℃延伸10min。PCR反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并純化回收目的片段, 將回收產物連接到克隆載體pMD19-T(TaKaRa公司)得到重組質粒pMD19-TTRIM32, 將其轉化到E.coli.DH5α感受態細胞(TaKaRa公司)。經Ampicillin抗性篩選, 挑取陽性菌落, 擴大培養后進行菌液PCR鑒定, 并由武漢擎科新業生物技術有限公司測序。

1.4 TRIM32序列分析及系統進化樹分析

將測序所得核苷酸序列及相應的氨基酸序列用BLAST程序比對分析, 用CLUSTAL軟件對不同物種TRIM32各結構域進行比對分析, 系統進化樹的構建使用MEGA6.06軟件進行對比分析。

1.5 TRIM32真核表達載體的構建與鑒定

提取鑒定正確的重組質粒pMD19-T-TRIM32,經BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切后膠回收, 以摩爾比3鯰1連接到經相同雙酶切的質粒pcDNA4.0。轉化至E.coli.DH5α感受態細胞, Ampicillin抗性篩選, 挑取陽性克隆培養并進行菌落PCR鑒定, 所構建的重組表達載體初步命名為pcDNA4.0-TRIM32, 并送至武漢擎科測序公司進行序列測定。

1.6 免疫印跡鑒定TRIM32基因的表達

轉染36h后收集細胞, 用預冷的細胞裂解液裂解細胞, 冰上放置15min; 將細胞裂解液4℃ 12000 r/min離心15min, 上清為獲取的細胞總蛋白; 不同處理樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳; 電泳后, 12V電壓過夜轉移蛋白至PVDF膜; 用封閉液(含1% BSA的TBST)在室溫下封閉1h; 加入一抗鼠源抗His標簽抗體和HRP-羊抗鼠二抗后, 將PVDF膜放入化學發光底物A和B液的等量混合液中進行避光顯色, 用化學發光成像系統進行照相。

1.7 TRIM32蛋白在EPC細胞中的定位

用轉染試劑lipo 2000將重組質粒pcDNA4.0-TRIM32轉染至EPC細胞。具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。轉染質粒用量為0.8 μg, 轉染4h后更換細胞培養液, 36h后用PBS洗滌細胞3次, 每次5min。100%甲醇室溫固定10min, PBS洗滌3次, 每次5min。用封閉液(含1% BSA的PBS)封閉30min, PBS洗滌3次, 每次5min。加入封閉液稀釋的鼠源一抗(抗His標簽), 孵育1—2h, PBS洗滌3次, 每次5min。加入封閉液稀釋的羊抗鼠二抗, 孵育45min, PBS洗滌3次, 每次5min。加入適量PBS, 防止干樣。在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染細胞的熒光并拍照。

1.8 草魚TRIM32在不同組織及不同胚胎發育時期的表達

試驗草魚為1齡草魚, 魚體全長20—25 cm, 體重350—400 g。試驗魚體在實驗室暫養1周后, 于冰上解剖取肌肉、腦、眼、鰓、心、肝、腎、頭腎、脾、皮膚、腸道各50—100 mg于1 mL Trizol試劑中, 分別取3組作為3個平行。按照Trizol使用說明提取總RNA反轉錄成cDNA, 用實時熒光定量PCR檢測TRIM32在不同組織的相對表達量。試驗魚卵在受精后于28℃水溫中進行孵化, 在光學顯微鏡下觀察受精卵胚胎發育情況, 并在受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經胚期、眼囊期、心跳期各取3粒受精卵于1 mL Trizol試劑中(重復3個平行), 在出膜期、出膜后1d、出膜后2d、出膜后3d、出膜后4d、出膜后5d取3尾魚苗于1 mL Trizol試劑中(重復3個平行), 按照Trizol使用說明提取總RNA反轉錄成cDNA, 用實時熒光定量PCR檢測TRIM32在不同胚胎發育時期的相對表達量。在此次試驗中受精卵時期為受精后3min, 卵裂期為受精后1h, 囊胚期為受精后2.5h, 原腸期為受精后10h, 神經胚期為受精后12h, 眼囊期為受精后14.5h, 尾鰭期為受精后18.5h, 心跳期為受精后19.5h, 出膜期為受精后22h。實時熒光定量PCR 20 μL反應體系: cDNA模板2 μL, 上游引物RT-F 0.8 μL, 下游引物RT-R 0.8 μL, SYBR green Real-time PCR master mix 10 μL, 加水至20 μL。PCR擴增程序: 95℃3min; 95℃ 10s, 58℃ 30s, 40個循環; 72℃延伸10min。

1.9 雙熒光素酶報告實驗檢測草魚TRIM32對NF-κB活性的影響

雙熒光素酶活性測定按照Promega公司提供的分析系統說明書進行。除去細胞培養基, PBS沖洗細胞, 加入Passive Lysis Buffer(PLB)細胞裂解液100 μL, 室溫輕緩晃動培養板15min后再吹打細胞,收集細胞裂解液, 通過生物化學發光分析儀(德國Berthold公司) 進行雙熒光素酶活性測定。以螢火蟲熒光素酶的活性與海腎熒光素酶活性的比值表示被檢測的質粒在轉染細胞后所測得的熒光素酶的相對活性。

1.10 統計學分析

所有的實驗至少重復3次。數據以平均值±標準偏差的形式表示, 采用Welch校正的非配對t檢驗。P≥0.05認為無顯著性差異; P<0.05認為差異顯著, 用“*”表示; P<0.01認為差異非常顯著, 用“**”表示。

2 結果

2.1 TRIM32基因克隆

從草魚脾臟組織中提取總RNA, 以反轉錄獲取的cDNA為模板, 擴增TRIM32 CDS區全長。經瓊脂糖凝膠電泳檢測, 結果顯示均在大約2000 bp位置檢測到特異性目的條帶(圖 1)。將擴增片段純化回收連接到克隆載體pMD19-T得到重組質粒pMD19-TTRIM32, 經測序草魚TRIM32 CDS區全長為1980 bp。

2.2 TRIM32序列分析

草魚TRIM32同其他物種的核苷酸序列比對結果表明, 草魚TRIM32與斑馬魚(Danio rerio)和鯉(Cyprinus carpio)具有很高的同源性, 分別為87%和90%, 而與人類(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性相對較低, 只有71%和73%。同時氨基酸結構域對比分析表明草魚TRIM32具有典型的RING結構域、B-BOX結構域以及SPRY結構域等保守結構域(圖 2)。

圖 1 TRIM32 PCR產物Fig.1 PCR product of TRIM32

2.3 TRIM32系統進化樹分析

通過草魚與其他物種的TRIM32構建系統進化樹來進行拓撲結構分析(圖 3), 結果表明草魚TRIM32與斑馬魚和墨西哥脂鯉(Astyanax mexicanus)的親緣關系較近, 遺傳進化分析聚為一支, 與爬行類的揚子鱷(Alligator sinensis)和哺乳類的人、小白鼠的遺傳距離較遠。

2.4 TRIM32真核表達產物免疫印跡檢測

構建重組質粒pcDNA4.0-TRIM32并轉染至EPC細胞, 經Western-blotting分析檢測TRIM32的表達情況, 結果顯示在約75 kD處有特異性條帶, 且與目的蛋白理論大小一致, 而空載體pcDNA4.0轉染組無特異性條帶, 證明目的蛋白在EPC細胞中得到表達(圖 4)。

2.5 TRIM32蛋白在EPC細胞中的定位

將重組質粒pcDNA4.0-TRIM32轉染至EPC細胞, 36h后進行間接免疫熒光試驗檢測, 同時以空載體pcDNA4.0轉染EPC細胞作為對照。結果顯示: 在pcDNA4.0-TRIM32轉染組中有明顯的綠色熒光, 表明TRIM32蛋白主要以點狀分布在細胞質中, 細胞核中表達量較少(圖 5)。

2.6 草魚TRIM32在不同組織及不同胚胎發育時期的表達分析

采用實時熒光定量PCR對TRIM32基因在草魚不同組織的表達進行分析, 結果表明TRIM32在草魚的組織中廣泛表達, 而在頭腎組織中TRIM32的表達水平最高, 脾臟與腦組織次之, 肌肉組織中表達量最少(圖 6)。

圖 2 草魚TRIM32蛋白與其他物種序列比對Fig.2 Grass carp（C.idellus）TRIM32 amino acids sequence

圖 3 草魚與其他物種TRIM32的進化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree of TRIM32 from grass carp (C.idellus) and other species

圖 4 Western blotting檢測TRIM32在EPC細胞中的表達Fig.4 Western blotting of TRIM32 in EPC cells

對草魚不同胚胎發育時期TRIM32的表達量進行了分析, 結果表明TRIM32在整個胚胎發育時期均有表達, 而在受精卵時期、卵裂期和囊胚期的表達量顯著高于其他時期, 隨后表達量下降, 直到出膜后表達量再次顯著升高(圖 7)。

2.7 草魚TRIM32激活轉錄因子NF-κB

將pcDNA4.0-TRIM32質粒、pNF-κB-Luc質粒和pRL-TK質粒共轉染EPC細胞, 48h后, 用雙熒光素酶報告系統檢測, 結果顯示: 轉染草魚TRIM32報告基因組活性是對照組的1.66倍(圖 8), 說明草魚TRIM32能夠激活NF-κB的活性。

3 討論

3.1 草魚TRIM32的克隆及生物信息學分析

本研究成功克隆了草魚TRIM32基因的編碼區全長, 核苷酸序列比對分析表明與斑馬魚、鯉具有很高的同源性, 分別為87%和90%, 同時與人類、小鼠也具有較高的相似性。蛋白預測分析表明, TRIM32含有一個RING結構域、一個B-box結構域和一個SPRY結構域。從魚類到人類的演化過程中,重要功能區域RING結構域較為保守, 說明該基因在脊椎動物的生命活動中起到不可替代的重要作用[17]。這與之前的一些研究結果相似, 如人類與斑馬魚TRIM家族的基因同源性比較及進化分析表明,該TRIM家族基因的進化與物種進化相一致[18]。這說明了該結構域在進化中的保守性及生理功能的重要性。此外, 草魚TRIM32主要以點狀分布在細胞質中, 細胞核中表達量較少, 這一現象與哺乳動物中的報道一致[6]。

圖 6 草魚TRIM32基因在不同組織中的表達Fig.6 The relative mRNA level of TRIM32 in different tissues

圖 7 草魚TRIM32基因在不同發育時期胚胎中的表達Fig.7 Expression profile of TRIM32 during different early embryonic development stages

圖 8 TRIM32激活NF-kB的相對熒光活性Fig.8 Induction of NF-kB relative luciferase activity by TRIM32 protein

3.2 草魚TRIM32的表達分析

TRIM32在草魚的組織中廣泛分布, 在頭腎組織中的表達水平明顯高于其他組織, 表明該蛋白可能與機體的免疫功能相關。草魚在不同胚胎發育時期TRIM32的表達情況顯示, 該蛋白在整個胚胎發育時期均有表達, 在受精卵時期、卵裂期和囊胚期的表達量顯著高于其他時期, 隨后表達量下降,直到出膜后表達量再次顯著性升高。因此推測胚胎在出膜之前, 由于卵膜的保護作用, 或許不需要功能性的防御系統[19]。TRIM32在胚胎發育早期表達水平較高, 隨著發育的進行, 在原腸胚期下降到最低水平直到心跳期都一直保持著較低水平。這說明TRIM32在早期的高表達主要與受精卵中母性遺傳物質存在較多有關[20]。TRIM32在出膜期表達量又顯著性升高, 并在出膜后一直保持著相對較高水平, 表明在胚胎發育早期抵抗病原體感染方面可能發揮著重要作用。

3.3 草魚TRIM32的功能探究

草魚TRIM32在EPC細胞中過表達后, 通過雙熒光素酶系統檢測顯示, 轉染草魚TRIM32報告基因活性是對照組的1.66倍。這說明草魚TRIM32的功能和哺乳動物TRIM32的功能類似, 能夠激活NF-κB信號通路, 誘導下游的炎癥反應[21,22]。草魚TRIM32誘導的數量級低于TRIM32在哺乳動物細胞中過表達的數量級, Zhang等[23]在293細胞中TRIM32對NF-κB的誘導是對照組的9倍。在魚類研究中也有類似的報道, CgsMyD88在大鯢肌肉細胞(GSM)中的報告基因活性是對照組的1.88倍[24],明顯低于大西洋鮭魚MyD88在293細胞中的數量級[25],猜測可能由于NF-κB啟動子的來源不同導致。此外, 在本實驗中熒光的活性低于在哺乳動物細胞中的活性, 可能是由于魚類細胞的轉染效率低于哺乳動物, 使得TRIM32的表達量較低, 從而導致數量級較低。

綜上所述, 本研究成功克隆了草魚TRIM32編碼區全長, 該序列含有TRIM家族特有的結構特征。TRIM32的組織表達結果顯示TRIM32在頭腎組織中的表達量顯著高于其他組織; 不同胚胎發育時期的表達分析進一步表明, TRIM32在受精卵時期、卵裂期和囊胚期的表達量顯著高于其他時期,隨后表達量下降, 直到出膜后表達量再次顯著性升高。此外, 通過雙熒光素酶檢測系統顯示TRIM32能夠激活NF-κB信號通路, 誘導下游的炎癥反應,說明草魚TRIM32在天然免疫中扮演著重要角色,但其具體機制還需進一步探究。

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THE PRELIMINARY STUDY ON CLONING, EXPRESSION PROFILES AND FUNCTION OF GRASS CARP (CTENOPHARYNGODON IDELLUS) TRIM32

JIA Lu-Lu1,2,3,4, ZENG Ling-Bing2, WANG Fang1,3,4, PENG Jun-Jie1,3,4, WANG Ye-Da1,3,4, ZHOU Yong2and LIU Xue-Qin1,3,4
(1.Department of Aquatic Animal Medicine, College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2.Chinese Academy of Fishery Sciences, Yangtze River Fisheries Research Institute, Wuhan 430070, China; 3.Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province, Wuhan 430070, China; 4.Hubei Provincial Engineering Laboratory for Pond Aquaculture, Wuhan 430070, China)

The TRIM family, an important member in natural immune system, regulates cell proliferation, differentiation, apoptosis, tumor suppression, antiviral activity and other processes.The TRIM32 full-length sequence of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) was cloned by using PCR method.It was 1980 bp in length encoding 660 amino acids.The TRIM32 protein has three typical structural features of the TRIM family.Sequence analysis indicated that TRIM32 of grass carp shared the highest identity with zebrafish, which belongs to the same branch on the phylogenetic trees.Immunofluorescence and Western-blotting showed that TRIM32 successfully expressed in cytoplasmic speckles of EPC cells.Tssue distribution analysis showed that TRIM32 was widely expressed, especially in the renal tissue.TRIM32 was significantly higher in zygote period, cleavage and blastula stage than that of the other stages during different stages of embryonic development, and then decreased until hatching in which it increased significantly.In addition, grass carp TRIM32 can activate the nuclear factor NF-κB based on dual luciferase assay and induce inflammation.

TRIM32; Cloning; Eukaryotic expression; NF-κB

Q344+.1

A

1000-3207(2017)04-0741-07

10.7541/2017.92

2016-07-07;

2016-11-07

湖北省科技支撐計劃項目(2015BBA234)資助 [Supported by the Science & Technology Supporting Program from Hubei Province (2015BBA234)]

賈路路(1991—), 女, 河南濮陽人; 碩士; 主要從事魚類疾病學研究。E-mail: 15527985398@163.com

劉學芹, 女, 山東煙臺人; 博士, 教授, 碩士生導師; 主要從事水產病毒致病機理與綜合防控研究。E-mail: xueqinliu@mail.hzau.edu.cn