DNA復制的酶學機理

林 權 胡雪峰

(福建師范大學生命科學學院 福州 350108)

DNA復制分為解螺旋、合成新鏈、形成兩個子代DNA分子三個主要步驟，每個步驟對應著更為復雜的過程，這些過程均需要酶的催化。人教版高中生物學教材必修2中簡單介紹了DNA復制的過程，本文結合高中生物學教材的內容，在DNA復制流程的基礎上，介紹相關酶的功能及其作用機理。

1 DNA解旋酶作用氫鍵解開DNA雙鏈

DNA復制是指以親代DNA的兩條單鏈區域為模板合成子代DNA的過程，發生在有絲分裂間期的S期和減數第一次分裂前間期的S期。DNA分子為反向平行雙螺旋結構，復制起始需在復制起始識別蛋白和DNA解旋酶共同作用下打開DNA雙鏈片段，為后續新鏈的合成提供模板。

解旋酶是指利用ATP水解獲得能量打開氫鍵解開雙鏈DNA，并附著于DNA分子上沿一定方向移動的一類酶。復制起始識別蛋白識別復制起點，隨后環狀結構的解旋酶圍繞在復制起點處的一條DNA鏈上，沿復制叉(以解開的兩條DNA單鏈區域為模板，從一個固定的起點開始復制，形成的結構類似叉子，故稱復制叉[1])前進的方向移動并斷開堿基對之間的氫鍵，解開局部雙鏈。緊接著，單鏈結合蛋白結合于DNA單鏈區域，阻止單鏈DNA重新締合成雙鏈。

2 DNA拓撲異構酶消除正超螺旋

DNA拓撲異構酶的主要功能是消除正超螺旋。DNA復制過程中復制叉向前移動會積累巨大的張力，致使DNA分子的雙螺旋變緊，即產生正超螺旋，阻礙了DNA的解旋和復制。DNA拓撲異構酶分為DNA拓撲異構酶Ⅰ和DNA拓撲異構酶Ⅱ，DNA拓撲異構酶Ⅰ斷開一條DNA鏈上的磷酸二酯鍵，而DNA拓撲異構酶Ⅱ作用于兩條DNA鏈上的磷酸二酯鍵，使單鏈或雙鏈DNA片段適當旋轉舒展DNA鏈，再連接磷酸二酯鍵，達到釋放張力的目的。因此，DNA拓撲異構酶可作為DNA解旋酶的“先導部隊”，消除阻礙解旋進行的正超螺旋[2]。

3 DNA新鏈的合成

3.1 引發酶催化合成RNA引物 DNA聚合酶不能從頭起始DNA新鏈的復制，只能在已有引物的3′-OH末端繼續延伸。引發酶利用核糖核苷酸為底物，按照堿基互補配對原則，合成RNA引物產生3′-OH末端，為DNA聚合酶合成新鏈做鋪墊。DNA半保留復制中，DNA的結構為反向平行，合成DNA的底物為5′-核苷三磷酸，只能5′-位的磷酸基團連接到引物的3′-OH上形成磷酸二酯鍵，故DNA復制的方向只能按新鏈5′→3′方向進行。復制時，DNA的一條新鏈按與復制叉移動方向一致的方向進行合成，即沿新鏈DNA 5′→3′方向連續合成，稱為前導鏈；另一條鏈按與復制叉移動方向相反的方向，沿新鏈DNA 5′→3′方向合成多個小片段DNA，小片段DNA稱為岡崎片段，再通過連接酶將岡崎片段連接成完整的鏈，稱為后隨鏈[1]。前導鏈連續復制，只需要一個RNA引物，而后隨鏈的合成是不連續的，每個岡崎片段都需要一個RNA引物。

3.2 DNA聚合酶合成親代DNA的互補鏈 DNA聚合酶Ⅲ是原核生物DNA復制的主要酶，具有5′→3′的聚合酶活性。DNA復制以復制叉處解開的兩條DNA單鏈區域為模板，利用游離脫氧核苷酸的5′-核苷三磷酸與RNA引物的3′-OH發生酯化反應，形成磷酸二酯鍵，展開前導鏈和后隨鏈的合成。真核生物中，DNA聚合酶α結合在引物-模板接頭上，起始新鏈的合成。然而其持續性低，每次與引物-模板結合最多只能添加100個左右的脫氧核苷酸[3]。后續的DNA合成由具備高持續合成能力的DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε完成[1]。

4 形成兩個新的DNA分子

前導鏈和岡崎片段一旦合成，其RNA引物就要被切除。原核生物中，引物切除后的空缺由DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合酶活性利用脫氧核苷酸進行補齊，最后DNA連接酶連接岡崎片段形成一條完整的后隨鏈。新合成的兩條鏈與其對應的模板鏈相互纏繞成雙螺旋結構，形成兩個相同的DNA分子。

4.1 RNA引物的酶切 前導鏈上有一個RNA引物需切除，而后隨鏈有多個RNA引物需要切除。原核生物中切除RNA引物的酶為DNA聚合酶Ⅰ或核糖核酸酶H[4]。DNA聚合酶Ⅰ使用5′→3′外切酶活性切除5'端的引物，核糖核酸酶H是一種專門水解與DNA雜交的RNA的核酸內切酶。真核生物的DNA聚合酶無5′→3′外切酶活性，不能切除RNA引物，而是使用核糖核酸酶和翼式核酸內切酶-1(FEN-1)進行切除，FEN-1具有5′→3′外切酶活性和內切酶活性切除RNA 引物[1]。

4.2 DNA連接酶連接岡崎片段 DNA連接酶在DNA復制、修復和重組的過程中具有十分重要的作用，其所催化的連接反應需要ATP或NAD+提供能量。不管是依賴ATP還是NAD+提供能量的DNA連接酶，其反應機理是相近的。第一步：連接酶腺苷酸化，ATP或NAD+中的腺苷酰基(AMP)移動至酶活性中心的賴氨酸殘基的ε-氨基上，暴露出連接酶上的DNA結合位點，形成共價復合物中間體；第二步：中間體的腺苷酰基(AMP)轉移給切口處DNA的5′-P，產生焦磷酸鍵，活化切口處DNA的5′-P，形成DNA-AMP中間復合物；第三步：被激活的5′-P與相鄰DNA的3′-OH生成磷酸二酯鍵，釋放出AMP，兩個DNA片段連接完成(圖1)。

圖1 DNA連接酶催化DNA片段的連接

5 小結

總之，DNA復制的過程非常復雜，需要多種酶及蛋白因子的共同協作配合。其在復制叉處進行的基本過程包括松弛超螺旋，解開DNA區域雙鏈，合成RNA引物，延伸前導鏈及后隨鏈，RNA引物切除，岡崎片段的連接。原核生物DNA復制與真核生物DNA復制不同之處主要是：①原核生物的DNA在細胞中呈裸露狀態，而真核生物的DNA與組蛋白緊密結合形成核小體顆粒，核小體盤繞螺旋構成染色質。因此，真核生物DNA復制前要先解開核小體，降低了其DNA復制的速度。②真核生物有多個復制起點，只有全部染色體完成第一輪復制，各個起點才能展開第二輪的DNA復制；原核生物雖只有一個復制起點，但是第一輪DNA復制還未結束，復制起點便又開始第二輪的復制。③真核生物DNA復制涉及的酶和蛋白因子種類比原核生物多。④真核生物的岡崎片段比原核生物小。

(基金項目：福建省“大規模教育考試試題難度影響和難度預測的研究”，No.FJJKCG14-083；* 通信作者)