人教版選修教材中“基因工程”教學難點的解決策略

胡 玉

(河南省基礎教育教學研究室 鄭州 450016)

自20世紀70年代誕生以來，基因工程已經成為生命科學中最具活力的前沿領域之一。引導學生深入理解基因工程的基本原理和技術流程，了解基因工程在農業、醫療、環境保護等方面的廣泛應用及發展前景，可較好地拓展學生的科技視野、增強學生的科技意識，尤其是對那些有志于從事生物科學研究的學生，更顯得至關重要。但是，這部分內容比較抽象，有一定難度。

現以人教版選修教材中基因工程的部分內容為例，探討在實際教學過程中兩個常見難點的解決策略。

1 關于“利用PCR技術獲取目的基因”

如何利用PCR技術從大量DNA分子中獲取目的基因？對于我們需要的目的基因，必須知道該基因兩端的部分堿基序列，否則是不能利用這種方法獲取目的基因的。根據基因兩端的已知序列，合成相應引物，利用該引物擴增目的基因。只有特定的引物，才能擴增出特定的DNA片段(目的基因)。由于學生對于PCR技術的原理及過程可能并不熟悉，對于引物的作用就不能理解。所以，有必要先講解PCR技術的原理及反應過程。

1.1 介紹引物及其作用 DNA聚合酶(PCR中為Taq酶)只能從脫氧核苷酸鏈的一端添加單個脫氧核苷酸，而不能直接起始一條新鏈。要擴增DNA分子中的一個基因，至少要知道該基因兩端的部分堿基序列，以便于根據已知序列設計引物(能和基因兩端已知序列進行堿基配對的短的脫氧核苷酸鏈)。由于DNA聚合酶只能從3′—OH端添加單個脫氧核苷酸，所以設計的引物對應該分別和待擴增基因兩條鏈已知序列的5′—OH端互補結合，以便于在DNA聚合酶的作用下，使單個脫氧核苷酸從引物的3′—OH端添加上去，使新合成的鏈沿5′—OH→3′—OH方向延伸。

反應體系中要一次性加入足量的引物(足夠30～40次循環)、足量的dNTP(即：dATP、dCTP、dGTP、dTTP，“d”代表“脫氧”；“T”代表“三個”；“P”代表“磷酸”“A、C、G、T”分別代表四種含氮堿基，它們是分別由四種普通的脫氧核苷酸在消耗ATP的基礎上活化而成的)，中間不需要再次加入。

1.2 介紹PCR過程 ①變性(90℃～95℃)：DNA模板在加熱作用下，堿基對之間的氫鍵斷裂，形成兩條單鏈；②復性(退火)(55℃～65℃)：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈；③延伸：(70℃～75℃)：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的子鏈。

圖1 聚合酶鏈式反應(PCR)體外擴增 DNA技術的基本原理[1]

結合圖1介紹PCR過程之后，提出問題：利用PCR技術擴增目的基因，引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。現加入含有目的基因的DNA分子、引物對A、B(分別和目的基因兩條鏈的5′端結合)、dNTP及其他必需物質進行PCR，在第幾輪循環產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段(目的基因)？第四輪循環結束后，產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為多少？

這個問題需要學生結合圖1進行思考，在這個過程中，他們能較好地理解PCR過程中復性時引物與模板鏈5′端的結合情況，以及目的基因到底是如何被克隆出來的。PCR擴增DNA片段的特異性是由一對引物所決定的。反應初期，原來的DNA擔負起模板的作用，隨著循環次數的遞增，由引物介導延伸的片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴增產物是介于兩種引物5′—OH端之間的DNA片段(即目的基因)。

經過這個過程的學習，學生能夠非常清晰地認識到如何通過PCR技術，從DNA分子上擴增出目的基因的過程。

2 關于“目的基因的運載體”

關于“目的基因的運載體”，教材只是重點介紹了質粒這種載體，充當載體的質粒需要滿足的條件和理由沒有進一步解釋；對其他載體與質粒的差別沒有進行描述；對于天然質粒的改造問題，教材沒有描述，后面構建表達載體也沒提及，學生不知其中的緣由。

對于這部分內容，學生最多的疑問如下：λ噬菌體的衍生物是什么？人工改造質粒是如何進行的？改造的目的是什么？因此，在教學過程中，這幾個問題有必要講解清楚，建議補充以下內容。

λ噬菌體基因組有60多個以上基因，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的活動，這些基因所在區段是噬菌體生長繁殖所必需的，在表達載體構建中為不可替代區；而另一部分基因對于噬菌體生長周期不是必需的，這些基因所在區域就稱為可替代區，如果用外源基因取代之后，并不影響噬菌體的生命功能，正是這一特點構成了λ噬菌體作為外源基因表達載體的基礎。野生型λ噬菌體DNA必須經過改造才能成為理想的載體，其構建過程主要有：①刪除基因組中非必需區，建立外源DNA片段的替換點，增加承載外源DNA片段的容量；②在非必需區內插入或替換選擇的標記基因和目的基因；③建立重組λDNA分子的體外包裝系統，使之有效地感染受體細胞。簡而言之，將目的基因插入或替換進入病毒基因組的可替代區，再利用病毒的侵染性,將目的基因導入受體細胞，這就是病毒作為“分子運輸車”的基本機理。

由于野生型λ噬菌體DNA對大多數目前在分子克隆中常用的限制酶有多個切點，而且有些位點恰巧定位于與噬菌體生長繁殖關系密切的必需基因之中，這些位點的剪切重組必然嚴重影響噬菌體的繁殖。因此，野生型λDNA不能直接用作載體而需經過改造才能成為有價值的克隆載體。天然λ噬菌體載體改造的關鍵是去除或改變其基因組必需區段內多余的限制酶切位點。改造方法包括點突變、基因組的置換和缺失。由天然λ噬菌體改造獲得的就是λ噬菌體的衍生物。

天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。

現在常用的質粒，都是早期利用天然質粒經歷多次改造而成的：如添加抗生素抗性基因(作為標記基因，便于篩選轉化成功的細菌)、添加 MCS (多克隆位點)區域等。所謂添加MCS，是質粒中的一段堿基序列，由數個酶切位點組成，這些位點在載體上都是單一位點[1]。