羧甲基茯苓多糖體外抗氧化活性研究

2017-08-22 06:26:53熊芳琪彭國平

中國食物與營養(yǎng) 2017年7期

熊芳琪，劉欣，楊嵐，彭國平

(湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，長沙 410128)

羧甲基茯苓多糖體外抗氧化活性研究

熊芳琪，劉欣，楊嵐，彭國平

(湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，長沙 410128)

目的：比較不同濃度洗脫液洗脫得到的羧甲基茯苓多糖的抗氧化活性。方法：以茯苓為原料提取茯苓多糖，進行羧甲基取代反應，分離和純化得到了均一性羧甲基茯苓多糖CMP-1、CMP-2、CMP-3、CMP-4，通過測定還原能力、DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率比較其體外抗氧化活性。結果：羧甲基茯苓多糖均表現出與濃度正相關的體外抗氧化活性，其中CMP-4具有相對更強的體外抗氧化活性。結論：所得羧甲基茯苓多糖樣品具有不同的體外抗氧化能力，隨著洗脫液濃度增加，抗氧化活性增強。

茯苓；羧甲基茯苓多糖；抗氧化活性

茯苓作為多孔菌科真菌的干燥菌核，具有利尿、調節(jié)免疫、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、保肝等作用[1]，其主要組成是茯苓多糖，約占干重的90%左右。

本研究采用二次加堿法[2]提取羧甲基茯苓多糖(CMP)，并進行分離純化得到不同組分的羧甲基茯苓多糖，采用4種不同的體外抗氧化測定體系進行抗氧化活性測定，為開發(fā)利用羧甲基茯苓多糖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

茯苓菌塊，采自湖南靖州白茯苓。二苯代苦味肼自由基(DPPH)，Sigma 公司；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、冰醋酸、氯乙酸、過氧化氫、三氯化鐵、水楊酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀，分析純國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 羧甲基茯苓多糖的制備將茯苓菌塊，粉碎過 60 目篩備用。精密稱取茯苓粉，加入 20 倍的水，超聲 30 min 后沸水浸提 2 h，過濾，用 5 倍的 NaOH 堿溶液浸提茯苓渣，置于4 ℃ 處理，抽濾得堿液，加入氯乙酸和 NaOH 溶液，70 ℃ 醚化反應 3 h，用乙酸中和至 pH 為7，采用 Sevage 法除去蛋白，活性炭吸附脫色，醇沉，離心，沉淀用水、無水乙醇、丙酮、無水乙醚進行洗脫，干燥，粉碎，得羧甲基茯苓多糖粉 CMP。

1.2.2 羧甲基茯苓多糖的分離純化[3]取一定量的 CMP 溶于雙蒸水，上樣到已平衡的 DEAE-52 離子交換柱上，用不同濃度的氯化鈉溶液洗脫，蒽酮硫酸法跟蹤檢測，根據洗脫曲線的主峰位合并收集液，透析，干燥，得到 5 個羧甲基茯苓多糖純化組分。將得到的 5 個組分分別溶解，上樣到已平衡的SephadexG-100 葡聚糖凝膠過濾層析柱，采用氯化鈉溶液洗脫，根據洗脫曲線的主峰位合并收集液，透析脫鹽，冷凍干燥，得到羧甲基茯苓多糖均一組分CMP-1、CMP-2、CMP-3和CMP-4，并根據峰面積計算各組分多糖含量。

1.2.3 還原能力的測定[4-6]配制濃度為10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，稀釋成不同濃度梯度。向1.0 mL羧甲基茯苓多糖溶液中加入0.2 mL PBS(0.2 mol/L，pH值6.6)和1.5 mL 0.3 % 鐵氰化鉀，搖勻，50 ℃ 恒溫反應30 min。加入1.0 mL三氯乙酸(10%)，3 000 r/min 離心10 min，取2 mL上清液與0.5 mL 三氯化鐵溶液(0.1%)，再加3 mL 蒸餾水混勻，蒸餾水調零，在700 nm 處測定吸光度。溶液吸光度越高，表示還原能力越強。

1.2.4 DPPH自由基清除率測定[7]配制濃度為10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，并稀釋成不同的濃度梯度。將2.0 mL的羧甲基茯苓多糖樣品溶液加入到2 mL DPPH 溶液中，混合均勻并在黑暗中反應30 min，測定517 nm處的吸光度。DPPH自由基清除率計算公式按式(1)計算：

清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

(1)

式(1)中，Ao為水代替樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為乙醇代替DPPH溶液時的吸光度。

1.2.5 羥基自由基的清除率測定[8]配制濃度為10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，并稀釋成不同的濃度梯度。依次加入2.0 mL FeSO4(9.0 mmol/L)溶液、2.0 mL水楊酸(9.0 mmol/L)溶液、2.0 mL樣品溶液，然后加入2.0 mL H2O2(8.8 mmol/L)啟動整個反應，37℃水浴后，以蒸餾水為對照，在510 nm 下測吸光度。羥基自由基清除率計算公式按式(2)計算：

清除率=[A3-(AX-AX0)]/ A3×100%

(2)

式(2)中，A3為不加樣品溶液的吸光度；Ax為加入樣品溶液后的吸光度；Axo是沒有添加顯色劑時樣品的吸收值。

1.2.1 不同灌水量對啤酒大麥生長的影響測定灌水量單因素5水平隨機區(qū)組設計，3次重復，每個處理的總灌水量分別為 W1：0 m3/hm2，W2：750 m3/hm2，W3：1500m3/hm2，W4：2250m3/hm2，W5：3000m3/hm2。試驗小區(qū)面積10 m2(2.5 m×4 m)，灌水分4次進行，如表1所示。條播，行距17 cm，播種深度3～5 cm；撒播先整理好小區(qū)后將種子均勻撒開，然后深犁，耙耱。試驗于2017年3月26日種植。

1.2.6 超氧陰離子自由基的清除[9]配制濃度為10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，并稀釋成不同的濃度梯度。取pH為8.2的Tris- HCl 緩沖液6 mL于比色管中，各自加入0.5 mL樣品溶液，37 ℃ 水浴10 min，然后加入預熱過的鄰苯三酚溶液，混勻，精確處理5 min，立刻用0.5 mL濃鹽酸打斷反應，測320 nm 處吸光值。對照組以Tris-HCl 緩沖液代替羧甲基茯苓多糖溶液。超氧自由基清除率按式(3)計算：

清除率=(A4-A5)/A4×100%

(3)

式(3)中：A4為加入樣品溶液后的吸光度；A5為對照組吸光度值。

2 結果與討論

2.1 羧甲基茯苓多糖分離結果

用不同濃度的氯化鈉溶液先后，0.05、0.1、0.15、0.2mol/L對層析柱進行洗脫。由圖1可以得知，經過 DEAE-52 纖維素層析柱對羧甲基茯苓多糖進行洗脫分離，主峰位合并得到4個多糖組分，分別是0.05 mol/L 氯化鈉溶液洗脫出來CMP-1，占總糖含量的8.47%；0.1 mol/L 氯化鈉溶液洗脫出來的組分CMP-2，占總糖含量的17.97%；0.15 mol/L 氯化鈉溶液洗脫出來的組分CMP-3，占總糖含量的13.56%；0.2 mol/L 氯化鈉溶液洗脫出來的組分CMP-4，占總糖含量的20.00%。洗脫出的多糖含量為總糖含量的60.00 %。從圖1中可看出4個洗脫峰明顯，說明其分離效果好。

2.2 還原能力測定結果

根據抗氧化活性成分的還原能力清除自由基，檢測吸光度，吸光度越大，還原能力越強，抗氧化能力越強。由圖2可知，所有樣品的還原能力與濃度呈正相關，還原能力大小依次為CMP-4>CMP-3>CMP-2>CMP-1。

2.3 DPPH自由基清除率

DPPH自由基可清除其他自由基，清除率越大，抗氧化能力越強[10]。由圖3可知，4種樣品對DPPH自由基的清除率都與濃度呈正相關，清除能力大小依次為CMP-4>CMP-3>CMP-2>CMP-1。

圖1 羧甲基化茯苓多糖DEAE-52洗脫曲線

圖2 羧甲基茯苓多糖的還原能力

2.4 羥基自由基清除率

H2O2/Fe2+通過Fenton 反應生成羥自由基，羥自由基能與水楊酸結合，產生在510nm處強吸收峰物質，加入具有清除作用溶液，則會與水楊酸競爭，使得顯色物質減少[11]。由圖4可知，所有樣品對羥基自由基的清除率與濃度均成正相關，清除能力大小依次為CMP-4>CMP-3>CMP-2>CMP-1。

2.5 超氧陰離子自由基清除率

超氧自由基的清除能力是反應藥物抗氧化能力的重要指標，在鄰苯三酚-魯米諾-碳酸緩沖液體系下測定羧甲基茯苓糖清除超氧陰離子的作用，經過反應后，超氧自由基形成其他的氧自由基[12]。由圖5可知，所有樣品對超氧陰離子自由基的清除率與濃度均成正相關。清除能力在0.6～4.0 mg/mL時，清除能力較差。當樣品濃度達到4.0 mg/mL時，CMP-4的清除率明顯高于其他3個樣，達到了20.46%。

3 結論

從茯苓中提取、進行羧甲基反應、分離和純化得到了均一性羧甲基茯苓多糖CMP-1、CMP-2、CMP-3、CMP-4。利用化學發(fā)光法評價體外抗氧化活性，表明羧甲基茯苓多糖對DPPH自由基和羥基自由基具有較好的清除作用，具有較高還原力和抗氧化能力。羧甲基茯苓多糖均表現出在一定濃度范圍內與體外抗氧化活性呈正相關，其中CMP4具有相對更強的體外抗氧化活性。

圖3 DPPH自由基清除率圖4 羥基自由基清除率圖5 超氧陰離子自由基清除率

4 討論

采用不同濃度的NaCl溶液，經DEAE-52纖維素層析柱對羧甲基茯苓多糖進行洗脫分離，得到的羧甲基茯苓多糖樣品具有不同的體外抗氧化能力，且隨著洗脫液濃度增加，抗氧化活性增強，其中0.2mol/mL的NaCl溶液洗脫得到的CMP-4抗氧化活性相對較好。羧甲基茯苓多糖具有較強的還原能力和較好的抗氧化活性，對羧甲基茯苓多糖的結構和抗氧化活性間的關系進行研究，將有利于羧甲基茯苓多糖的進一步開發(fā)和利用。◇

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