低強度脈沖超聲波在牽張成骨中對新生骨形成的實驗研究

于乃超，任志勇，宋君，王輝，魏長月

（1.陽光融和醫院 骨科，山東 濰坊 261000；2.中國人民解放軍第89醫院 全軍創傷骨科研究所創傷骨科，山東 濰坊 261021）

Ilizarov外固定架由前蘇聯醫學專家Gavriil Ilizarov于1952年在西伯利亞庫爾干設計[1]，該技術可用于解決骨折延遲愈合、骨矯形康復、肢體短縮等多個方面的難題。然而牽拉成骨技術也會產生一些令人頭疼的臨床問題，比如針道感染、術后護理程序繁瑣、周期長、新生骨質量差以及再次骨折需重新手術內固定等弊端。在Ilizarov技術中，怎么保證截骨延長區的成骨質量及成骨速度，大量學者做了相關的實驗研究。安全、有效地加快牽拉成骨的礦化進程成為該領域目前研究的熱點和焦點。EI-Bialy等曾做過系列研究報道，骨再生、新生骨形成在經過系統的低強度脈沖超聲波 (Low-Intensity Pulsed Ultrasound Stimulation，LIPUS)治療后，具有顯著的促進愈合作用。自上個世紀80年代，Duarte研究了多種超聲頻率信號對骨折愈合速度及新生骨形成質量的影響，結果證明所有對骨愈合有效的均為低強度脈沖超聲波，并且證實了每天15 min低強度的治療顯著提高了骨折愈合部位的骨強度[2]。近年來國外創傷研究學者對LIPUS引起了高度重視，這方面的基礎研究和臨床實驗取得一些進展，盡管國外有些學者研究超聲治療骨延長的臨床效果，但是時間較短，多為4～6周[3，4]，長時間的愈合情況隨訪結果以及生物力學方面的研究評價鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 動物分組及材料

中國成年家兔60只，體重1.5～2.0 kg，雌雄不限，由菏澤醫專動物實驗室提供。采用標準化單籠飼養管理，統一飼料喂養，同等采光通風條件，自由飲水。隨機分兩組：實驗組：低強度脈沖超聲波治療；對照組：不做干預。

低強度超聲骨折治療儀：Smith＆Nephew低強度超聲骨折治療儀，其強度為30 mw/cm2，工作頻率為1.5 MHz，脈沖寬度為200 μs，重復頻率為l kHz。

1.2 動物模型的制作

動物禁食水，用常規脫毛劑將左小腿脫毛，測量左小腿初始長度，精確測量脛骨初始全長。無菌條件下進行，兩組均采用氯胺酮肌注麻醉。麻醉起效后術區常規消毒鋪單。取左脛前內側入路，于左脛骨中上1/3處作縱行切口，依次切開，鈍性分離脛前肌，將肌層牽向兩側予以保護，暴露脛骨。先在脛骨粗隆下約1.0 cm處縱向將脛前骨膜作一長約1.0 cm切口，在此平面向遠近端適當游離，暴露脛骨，將線鋸由腓側穿入自脛側穿出，在干骺端行骨膜外截骨。為了方便放入外固定架，暫時保留脛骨前外側1/3骨皮質不被鋸斷以維持截面穩定性及下肢力線。將外固定架套入兔左下肢，分別在截骨面上下各1.0 cm處垂直打入兩組平行克氏針，用雙邊外固定架固定。固定結束后將脛骨近端截骨面完全鋸斷，旋緊螺絲帽分別加壓。在脛骨截骨線以遠0.5 cm水平將腓骨截斷，碘伏、生理鹽水沖洗創口，縫合后包扎固定。術后連續5 d注射抗生素預防感染，于術后第8天起開始延長外固定架近端，2次/d，每次牽張0.5 mm，牽張總長度為1.0 cm（共牽張10 d），隨后固定。骨牽張結束后固定期第2天，實驗組行低強度脈沖超聲波治療；對照組則不予處理。

1.3 觀察指標

X線攝片觀察：分別于固定期第28天，第56天，第84天拍攝兩組實驗動物左側脛骨全長X線片，仔細觀察不同時相段延長區的成骨情況。

HE染色組織學檢查：固定期第28天，第56天，第84天分別于兩組中隨機抽取8只實驗動物，在牽張成骨區內取材，HE染色，光鏡下觀察組織學變化。

骨密度測定：于固定期第84天將兩組處死的8只動物取標本，用Hologic QDR-2000雙能X線骨密度儀（中國人民解放軍第89醫院實驗中心）進行骨密度測定。

扭轉實驗：在固定期第84天，每組隨機抽取8只行力學實驗，測量最大扭矩，扭轉角，計算抗扭強度及剛度：Tb(抗扭強度)=Mn(最大扭矩)/Wn(抗扭截面模量)，GJP(抗扭剛度)=Mn·l(長度)/θ(扭轉角)。

2 結果

2.1 X線攝片觀察

固定期第28天：X線示兩組延長區均可見少量模糊低密度骨痂影，實驗組較對照組骨痂密度略高（圖 1）。

圖1，2兩組固定期第28天X線片

圖3,4兩組固定期第56天X線片

圖5,6兩組固定期第84天X線片

圖7,8兩組固定期第28天牽張間隙新生骨組織（HE 染色×100）

圖9,10兩組固定期第56天牽張間隙新生骨組織（HE 染色×100）

圖11,12兩組固定期第84天牽張間隙新生骨組織（HE 染色×200）

固定期第56天：X線示兩組新骨密度及數量均增加并充填于整個延長區，延長區內出現少量縱行排列的條索狀或片狀新骨影，骨延長區新生骨骨痂影由截骨斷端向中央生長，遠近截骨斷端有模糊的新生皮質骨征象。實驗組較對照組放射狀透光區減弱（圖 2）。

固定期第84天：實驗組髓腔通暢，骨折線消失，骨皮質完整，相比之下對照組骨折線稍顯模糊，部分皮質骨發育不良（圖3）。

2.2 HE染色觀察

固定期第28天：對照組可見炎性細胞減少，破骨細胞減少；實驗組可見炎性細胞減少，破骨細胞減少，少量纖維軟骨骨痂形成（圖4）。

固定期第56天：實驗組較對照組軟骨骨痂向骨性骨痂轉變明顯，骨細胞較肥大，鈣鹽沉積均勻（圖5）。

固定期第84天：實驗組新生骨組織主要以板層骨為主，骨痂形成改建過程成熟；對照組主要以編織骨為主，骨髓腔進一步改建，相對實驗組落后（圖6）。

2.3 骨密度測定

骨密度測定結果用SPSS 18.0統計程序在電子計算機上行統計學分析，實驗組較對照組差異有顯著性（P＜0.05）。兩組骨密度值排列順序為：實驗組＞對照組(表1)。

表1 兩組骨密度測試結果比較（配對t檢驗）

2.4 生物力學測試

在固定期第84天，每組隨機抽取8只行力學實驗，測量最大扭矩，扭轉角計算抗扭強度及剛度。結果各項指標用SPSS 18.0統計程序在電子計算機上行統計學分析。實驗組與對照組有統計學意義（P＜0.05），實驗組載荷強度較大（表2）。

實驗結果的統計學分析，實驗組的相對骨密度顯著高于對照組（P＜0.05），差別有統計學意義。說明超聲治療可以明顯提高骨密度，促進骨折愈合。

表2 兩組扭力測試結果比較±s)

表2 兩組扭力測試結果比較±s)

Group Mn(kg·cm) Tb(g/mm2) GJP(gcm2/ 度) θ(度 /cm)（最大扭矩） （抗扭強度） (抗扭剛度) （單位長度扭轉角）對照組 10.05±0.65 1543.54±10.62 3345.13±506.64 1.8630±0.25實驗組 14.13±0.47 1924.23±11.19 5213.00±537.28 3.2066±0.26

3 討論

3.1 低強度超聲促進骨折修復的作用及其機制

超聲波穿過和進入生物組織是由機械能量形式實現的，被作為診斷和治療工具廣泛應用于醫學領域中。最新研究表明，當機械負荷在低能量(5microstrain)高頻(30 Hz)的時候對骨組織可產生應答[5]。此外低強度脈沖超聲波引起的機械負荷不能誘導正常骨產生適應性效應[6,7]。但迄今為止低強度脈沖超聲波可促進骨折愈合及新生骨形成的生物學原理和機制仍不是很清楚。認為與超聲波可能導致骨質中靜態壓力變化有關。本研究是LIPUS模型在兔下肢骨建立，操作并不復雜，但是也受能量限制和多方面參數影響。另外我們發現經過LIPUS治療后BMP-2信使核糖核酸和蛋白質的表達增加，可以促進成骨作用和增強生物力學強度、剛度。實驗證明可以增強成骨細胞活動及骨形成，此外，礦物附著率增加，類骨質厚度和小脂肪細胞表達顯著增加，成骨細胞的活動以及骨組織分化，新骨生成和新生血管分化在骨愈合中發揮著重要作用。因此，加大LIPUS的應用能為現有的實驗及研究提供更有力的說服力。

3.2 低強度脈沖超聲對新生骨形成的影響

LIPUS能夠顯著促進骨延長區新骨形成和骨痂改建，當骨折或外傷導致的骨缺損后形成于骨折端的復合組織，在經過一系列的轉變，直至恢復原有的強度、剛度。LIPUS還能夠促進骨膜增生，形成骨膜新生骨，其X線上顯示為骨皮質外面局限性或廣泛性的層狀、帶狀、放射狀的高密度影。LIPUS能產生機械應力，它對骨的形成影響較大，反復承受高應力時，骨的大小、形狀和結構可因機械應力的變化而改變，骨密度可以增加，反之骨量將減少。骨折愈合過程中，壓應力和張應力將有助于骨的形成，而LIPUS能夠持續緩慢地施加這種壓力。除了促進骨折愈合外還可以檢測骨痂形成，形成系統的評估參數，超聲的傳播速度對新生骨形成骨痂的反射性結構改變是最靈敏的。骨密度掃描儀和X射線分析結果表明骨礦物質沉積的情況，說明LIPUS可以促進新生骨形成的礦物質沉積以及骨痂塑形改建，被逐漸骨化是一個非常重要的進程，實驗結果表明超聲可以促進骨密度鈣質沉積，并加速向正常骨密度恢復。

3.3 低強度超聲治療應用的研究進展

在過去的十多年中，大量的研究已經證實低強度脈沖超聲波對于新鮮骨折、延遲愈合和骨不連不愈合以及大段骨質缺損 (如截骨術后)均能促進愈合。通過有效的超聲波治療，17 d即可恢復骨的正常功能，而對側無超聲波治療恢復至正常骨的功能一般在損傷后的28 d左右[8]。Heckman等率先報道，利用低強度脈沖超聲波治療下肢骨折，與未經超聲處理對照組相比，骨折愈合的平均時間縮短了58 d[9]。Kristiansen（克里斯坦森）等發現，與對照組相比，結合臨床有效的低強度脈沖超聲波治療，能夠使橈骨遠端骨折的影像學和臨床愈合時間平均縮短37 d[10]。近年來，Mayr（邁爾）等證實治療舟狀骨骨折運用低強度脈沖超聲波可提前19 d治愈[11]。對這些臨床實驗結果進行比較，表明低強度脈沖超聲波能使脛骨、橈骨和舟狀骨骨折的臨床愈合時間縮短30%～38%。LIPUS是一種非侵入的治療方式，呈現低毒性、低免疫性，而且具有高度針對選擇性，且在實驗中可被反復使用，盡管LIPUS療法已經廣泛應用在醫學等領域，比如外科手術和骨創傷修復，其潛在可用性仍在初始階段，似乎LIPUS在骨組織的影響很好理解，但是文字資料仍匱乏。

許多研究已經表明，LIPUS有其獨特的優勢，這主要體現在以下幾個方面：⑴超聲波具有穿透性且不形成創傷，可進入和穿過生物組織，也可體外進行。⑵有效性：具有較好的臨床效果，本實驗可證實。⑶安全性：局部和全身治療均無損害。⑷操作方便，操作時間短。除了以上應用外，低強度脈沖超聲具有在運動損傷康復中的應用潛力。發現合適的超聲頻率、強度及范圍，并采取相應的處理，將更大程度地發揮超聲波的治療作用，減少副作用，是實驗研究的關鍵。治療期間，單次持續時間不同的條件下，取得骨折愈合良好的效果才是推廣超聲的基礎。超聲促進骨折愈合的作用機制至今還不是很清楚，但這一結論和超聲強度、頻率、治療方案是否有關，或合并有其他因素仍有待證實。自LIPUS首次被報道用于治療骨不連、骨缺損成功案例之后并在臨床應用，取得了一定療效，治愈率顯著提高。本研究的意義在于：⑴LIPUS可以促進骨折生物力學特性的恢復，在牽張成骨應用中可促進新生骨形成，提供了超聲治療的實驗室依據。⑵為骨矯形、大段骨缺損、骨不愈合的治療提供了一個新的方法。

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