FAT10在結直腸癌中的表達及其臨床病理意義

張春陽，王星，孫潔，王翠芳

（1.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院 急診科，遼寧 沈陽 110024；2.病理科）

結直腸癌是胃腸道最常見的惡性腫瘤，居男性惡性腫瘤的第4位，居女性第3位。世界范圍內的死亡率約為發(fā)病率的1/2，雖然治療方法不斷改進，但其預后并不樂觀。結直腸癌的病因和發(fā)病機制與環(huán)境和遺傳兩種因素有關：前者主要是飲食，尤其是脂肪和動物蛋白；遺傳因素本身以多種方式表現(xiàn)，最眾所周知的是結直腸癌好發(fā)于家族性腺瘤性息肉患者和Lynch綜合征患者，其他息肉病類型癌發(fā)生的比例非常低。基因水平上的研究發(fā)現(xiàn)，結直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的過程，涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活、突變以及凋亡基因的失調等。

泛素是細胞周期的關鍵調節(jié)因子，近年來越來越多的一些與泛素相關的低分子量蛋白，即泛素樣蛋白被鑒定出來，它們與多種細胞進程有關。迄今為止，兩個泛素樣蛋白家族被鑒定出來，分別命名為泛素樣修飾蛋白（the ubiquitin-like modifiers，UBLs）和泛素域蛋白（ubiquitin-domain proteins，UDPs）[1]。

FAT 10也稱雙泛素，屬于泛素樣蛋白的UBL家族。FAT 10是一個18 kD的蛋白，與泛素在N端和C端分別有29%和36%的同源性，最初認為它是定位于6號染色體的主要組織相容性復合體的一個基因[2]。盡管FAT 10的功能并未完整闡明，但有研究顯示它在多種細胞進程中發(fā)揮了重要作用。本研究應用免疫組化法檢測FAT 10在結直腸癌及癌旁組織中的表達情況，分析FAT 10的表達與結直腸癌臨床病理資料之間的關系。

1 資料與方法

1.1 結直腸癌組織標本

收集本院2010年3月-2011年3月結直腸癌患者外科手術切除標本61例，所有患者術前均未接受放、化療。其中男38例，女23例。患者中位年齡67歲（39～97歲）。中位腫瘤大小50 mm（25～110 mm）。高中分化46例，低分化15例。臨床分級Ⅰ期和Ⅱ期共22例，Ⅲ期和Ⅳ期共39例。淋巴結轉移38例，無淋巴結轉移23例。癌旁組織為距癌2 cm內的組織，正常結直腸黏膜組織取自手術切除標本切緣組織（距癌＞5 cm）。所收集標本均于手術切除后迅速保存于液氮中備用。

1.2 免疫組織化學染色及結果判定

組織標本經(jīng)中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm厚切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫苯、水化后，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法(S-P法)檢測FAT 10蛋白的表達。一抗為鼠抗人FAT10單克隆抗體 (1:200，Santa Cruz公司)，DAB顯色，以細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色。高倍視野(×400)下選陽性信號最強區(qū)域計數(shù)200個腫瘤細胞中陽性細胞數(shù)，按FAT10表達百分率分為以下五個等級：0%為0分，≤10%為1分，10%～50%為2分，51%～80%為3分，≥80%為4分。根據(jù)免疫組化染色強度分為四個等級：無染色為0分，淺棕黃色計為1分，棕黃色計為2分，黃褐色計為3分。以陽性細胞率和染色強度的分值之和 0，1，2，3，4，5，6，7 作為每一例的染色評分（IS，Immunoreactive score），得分＜4判定為陰性，積分≥4為陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學分析軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。對FAT10表達及其與臨床病理因素之間關系采用χ2檢驗，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Tamhane’s檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 FAT 10在結直腸癌組織中高表達

免疫組化結果顯示，正常結直腸黏膜及癌旁組織的細胞核中分別只有4例（6.56%）和11例（18.03%）FAT10呈核陽性，且多為弱陽性，其余均為陰性（圖1A）。按上述免疫組化染色評分，正常結直腸黏膜組織中只有1例（1.64%）、癌旁組織中有6例（9.84%）的FAT10表達可認為是陽性。結直腸癌中有46例FAT 10呈核陽性表達（75.41%），其中有39例為均勻的中等到強陽性（63.93%）（圖1 B）。結直腸癌組織與其對應的癌旁組織和正常結直腸黏膜組織相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,癌旁組織與其對應的正常結直腸黏膜相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）(表 1，圖 2)。

2.2 結直腸癌中FAT10的表達與腫瘤分期及淋巴結轉移相關

在61例結直腸癌中，我們對FAT10的表達與一些臨床病理學參數(shù)（包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期、分化以及淋巴結轉移情況）之間關系進行分析，結果發(fā)現(xiàn)FAT10的表達與腫瘤臨床分期及淋巴結轉移相關（表2）。

圖1免疫組織化學（S-P法）檢測FAT10在結直腸組織中的表達（原始放大倍數(shù)：100×）；A FAT10在結腸癌旁組織中陰性表達；B FAT10在中分化結腸腺癌中呈強陽性表達

圖2 FAT 10在正常結直腸黏膜組織、癌旁組織及結直腸癌中表達的半定量分析

表1 FAT 10在結直腸組織中的表達（x±s）

表2 61例結直腸癌中FAT 10表達與臨床病理學參數(shù)相關性分析

3 討論

FAT10，泛素化調節(jié)蛋白，調節(jié)多種細胞進程，包括有絲分裂、染色體穩(wěn)定性、凋亡、免疫控制和26S蛋白酶體介導的蛋白質轉換[3，4]。FAT 10能夠與人紡錘體聚集檢測點蛋白（mitotic arrest deficie-ncy 2，MAD 2）非共價結合，而此蛋白負責在有絲分裂時保持紡錘體的完整性，MAD 2功能受到抑制則導致染色體不穩(wěn)定，這是許多腫瘤發(fā)生的重要特征[5]。

已在一些惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)FAT 10基因過度表達，其過度表達可導致致癌細胞及非致癌細胞惡變[6]，并與人紡錘體聚集檢測點蛋白（mitotic arrest deficiency 2，MAD 2）非共價結合，而此蛋白負責在有絲分裂時保持紡錘體的完整性[7]，這其中包括胃腸道和婦科的惡性腫瘤。有報道稱IFN-γ和TNF-α能夠上調FAT 10基因表達[2,6,10]。并已經(jīng)確定為FAT 0的相互作用蛋白[12]，而P 53在調節(jié)細胞周期過程中發(fā)揮重要作用[13]。一些惡性腫瘤中FAT 10的異常高表達，細胞周期前中期細胞中高表達FAT 10蛋白，MAD 2著絲粒位點所導致的非染色體分離有絲分裂和染色體不穩(wěn)定性，并且FAT 10的表達受TNF-α（一個假定的腫瘤啟動子）正調節(jié)[4,14]，受P 53（基因組的守護者）負調節(jié)[15]，這些都提示FAT 10在調控細胞周期和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

我們的實驗結果顯示，F(xiàn)AT 10蛋白在結直腸正常黏膜組織、癌旁組織和結直腸癌中的陽性表達率逐漸增高，提示FAT 10表達增加在結直腸癌的癌變過程中可能發(fā)揮了重要作用。

此外，在61例結直腸癌中，我們對FAT 10的表達與一些臨床病理學參數(shù)（包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期、分化以及淋巴結轉移情況）之間關系進行分析，結果發(fā)現(xiàn)FAT 10的表達與腫瘤的臨床分期及淋巴結轉移相關。臨床分期Ⅲ+Ⅳ期的結直腸癌中FAT 10表達明顯高于臨床分期Ⅰ+Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學意義；有淋巴結轉移的結直腸癌更易于表達FAT 10。這些在一定程度上說明了FAT 10與結直腸癌的惡性程度及癌細胞的侵襲、增殖密切相關。

綜上所述，F(xiàn)AT 10作為一個泛素樣修飾蛋白，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，本研究發(fā)現(xiàn)FAT 10在結直腸癌中表達增高，且與結直腸癌的臨床分期及淋巴結轉移密切相關。因此，深入研究探討FAT 10在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制，尤其是其與細胞周期的關系，明確FAT 10在結直腸癌中的診斷、預后及治療價值將是十分必要的，這也是我們下一步研究的目標。

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