青蒿素抑制胃癌細胞增殖及侵襲的實驗研究

錢斌　李小軍　陳蔚

[摘要] 目的 研究青蒿素對胃癌細胞增殖及侵襲的影響。 方法 培養胃癌SGC-7901細胞株并用含有不同劑量青蒿素的無血清DMEM進行干預，分別作為75、150、300 μmol/L青蒿素組，以不含青蒿素的無血清DMEM作為對照組。干預后48 h時，測定細胞的增殖活力、侵襲數目及增殖基因、侵襲基因的mRNA表達量。 結果 處理后48 h時，75、150、300 μmol/L青蒿素組的細胞增殖活力、侵襲數目以及細胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9的mRNA表達量均顯著低于對照組，TIMP1、TIMP2的mRNA表達量均顯著高于對照組（P < 0.05），且青蒿素劑量越大，細胞增殖活力、侵襲數目以及細胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9的mRNA表達量越低，TIMP1、TIMP2的mRNA表達量越高（P < 0.05）。 結論 青蒿素能夠通過抑制細胞周期蛋白及基質金屬蛋白酶的表達來抑制胃癌細胞的增殖和侵襲。

[關鍵詞] 青蒿素；胃癌；增殖；細胞周期；侵襲

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（a）-0039-04

[Abstract] Objective To study the effect of artemisinin on the proliferation and invasion of gastric cancer cells. Methods Human gastric cancer cell line SGC-7901 was cultured and dealt with different doses of artemisinin in serum-free DMEM， respectively as 75， 150， 300 μmol/L artemisinin group， serum-free DMEM without artemisinin as control group. After 48 h of intervention， cell proliferation activity， invasion numbers and mRNA expression of proliferation gene， invasion gene were determined. Results After 48 h of intervention， cell proliferation activity， invasion numbers and Ki-67， CyclinD1， CDK4， CDK6， MMP2， MMP9 mRNA expression of 75， 150， 300 μmol/L artemisinin group were significantly lower than those of control group， TIMP1 and TIMP2 mRNA expression were significantly higher than those of control group （P < 0.05）， and the higher the dose of artemisinin， the lower the cell proliferation activity， invasion numbers and Ki-67， CyclinD1， CDK4， CDK6， MMP2， MMP9 mRNA expression， the higher the TIMP1 and TIMP2 mRNA expression （P < 0.05）. Conclusion Artemisinin can inhibit the proliferation and invasion of gastric cancer cells by inhibiting the expression of cell cycle proteins and matrix metalloproteinases.

[Key words] Artemisinin； Gastric cancer； Proliferation； Cell cycle； Invasion

胃癌是我國最常見的消化系統惡性腫瘤之一，近年來的發病率呈逐步升高趨勢。目前，胃癌的早期診斷率較低，多數患者確診時已經發展至中晚期且錯過了手術切除的機會。化療是中晚期胃癌的主要治療手段，但在化療過程中胃癌細胞會產生對化療藥物的耐藥性并影響化療效果、造成化療失敗[1-2]。因此，尋找治療中晚期胃癌的有效輔助藥物是臨床研究和基礎研究的熱點。青蒿素是從中藥材青蒿中分離得到的有效成分，臨床上主要用于瘧疾的治療。近年來基礎研究發現，青蒿素具有廣泛的抗癌活性，對膀胱癌[3]、宮頸癌[4]、乳腺癌[5]等多種惡性腫瘤細胞的生長均具有抑制作用。但是，青蒿素對胃癌細胞惡性生物學的影響尚不明確。本研究分析了青蒿素對胃癌細胞增殖及侵襲的抑制作用，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細胞株SGC-7901購買于中國科學院上海細胞所，DMEM培養基、胎牛血清及胰蛋白酶均購買于Hyclone公司（批號2016C0482），青蒿素購買于Sigma公司（批號2016C215），MTS細胞活力檢測試劑盒購買于Promega公司（批號2016-394），RNA抽提試劑盒（批號E2016-24）、cDNA第一鏈合成試劑盒（批號F2016-039）、熒光定量PCR試劑盒（批號A2016-77）購買于上海康為世紀公司，PCR引物由上海生工公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養方法 SGC-7901細胞株復蘇后用含有10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養，培養條件為37℃、5%CO2、飽和濕度，每2天更換1次培養基并觀察細胞生長狀態，待細胞生長至85%～90%后用0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代，消化后的細胞接種在培養板中并用于后續處理。

1.2.2 細胞處理方法 培養板中的細胞密度長至80%～90%后，棄去培養基并用不含血清的DMEM清洗2遍，而后加入含有不同劑量青蒿素的無血清DMEM進行干預，分別作為75、150、300 μmol/L青蒿素組，以不含青蒿素的無血清DMEM作為對照組。處理后48 h進行細胞增殖活力、侵襲數目及基因表達的檢測。

1.2.3 細胞增殖活力的檢測方法 用于細胞增殖活力檢測的細胞消化后接種在96孔細胞板中，不同條件處理48 h后，向培養孔內加入20 μL MTS試劑盒的檢測液，而后將培養板放回培養箱、繼續孵育3～4 h；待培養基變色后，將培養板放置在多功能酶標儀上，測定450 nm處的吸光度值并以該吸光度值作為細胞的增殖活力值。

1.2.4 細胞侵襲數目的檢測方法 用于細胞侵襲數目檢測的細胞消化后接種在Transwell小室內，不同條件處理48 h后取出小室，PBS洗2遍后去下小室底部的濾膜，結晶紫染色后在顯微鏡下觀察濾膜，隨機選擇3個高倍視野并對視野內的細胞數目進行計數，而后計算平均值，并以該平均值作為細胞侵襲數目。

1.2.5 細胞中基因mRNA表達量的檢測方法 用于基因mRNA表達量檢測的細胞消化后接種在12孔細胞板中，不同條件處理48 h后，棄去培養基并用PBS洗2遍，而后使用RNA抽提試劑盒分離細胞中的總RNA，將RNA反轉錄為cDNA后進行熒光定量PCR擴增，所擴增的基因包括Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、β-actin，擴增條件如下：95℃預變性3 min后95℃ 20 s、特異性退火溫度15 s、72℃ 20 s重復45個循環，根據擴增曲線、以β-actin為內參計算上述基因的mRNA相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件錄入并分析數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間計量資料比較采用方差分析，對方差分析有差異的數據進行LSD-t兩兩比較，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 青蒿素處理后的細胞增殖活力和侵襲數目

處理后48 h時，75、150、300 μmol/L青蒿素組的細胞增殖活力、侵襲數目均顯著低于對照組（P < 0.05），150、300 μmol/L青蒿素組的細胞增殖活力、侵襲數目均顯著低于75 μmol/L青蒿素組（P < 0.05），300 μmol/L青蒿素組的細胞增殖活力、侵襲數目均顯著低于150 μmol/L青蒿素組（P < 0.05）。見表1。

2.2 青蒿素處理后細胞中增殖基因的表達量

處理后48 h時，75、150、300 μmol/L青蒿素組細胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達量均顯著低于對照組（P < 0.05），150、300 μmol/L青蒿素組細胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達量均顯著低于75 μmol/L青蒿素組（P < 0.05），300 μmol/L青蒿素組細胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達量顯著低于150 μmol/L青蒿素組（P < 0.05）。見表2。

2.3 青蒿素處理后細胞中侵襲基因的表達量

處理后48 h時，75、150、300 μmol/L青蒿素組細胞中MMP2、MMP9的mRNA表達量均顯著低于對照組，TIPM1、TIMP2的mRNA表達量顯著高于對照組（P < 0.05）；150、300 μmol/L青蒿素組細胞中MMP2、MMP9的mRNA表達量均顯著低于75 μmol/L青蒿素組，TIPM1、TIMP2的mRNA表達量顯著高于75 μmol/L青蒿素組（P < 0.05），300 μmol/L青蒿素組細胞中MMP2、MMP9的mRNA表達量顯著低于150 μmol/L青蒿素組，TIPM1、TIMP2的mRNA表達量顯著高于150 μmol/L青蒿素組（P < 0.05）。見表3。

3 討論

中晚期胃癌目前尚缺乏有效的靶向治療藥物，常規化療容易產生耐藥性并影響化療效果[6-7]。因此，尋找治療中晚期胃癌的有效輔助藥物是臨床研究和基礎研究的熱點。青蒿素是從中藥材青蒿中提取得到的具有抗瘧疾作用的活性成分。近年來關于青蒿素的藥理學研究發現，青蒿素包括雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚等衍生物，其中以雙氫青蒿素的作用最為廣泛，具有廣泛的抗癌特性，能夠殺傷癌細胞，誘導癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖[8-10]。相關基礎研究證實，青蒿素對膀胱癌、宮頸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤細胞的生長均具有抑制作用。目前，關于青蒿素對胃癌細胞增殖、侵襲等惡性生物學行為的影響尚不明確。在本研究中，為了明確青蒿素對胃癌細胞惡性生物學行為的影響，首先對不同劑量青蒿素處理后胃癌細胞的增殖活力和侵襲數目進行了分析，結果顯示：不同劑量青蒿素組的細胞增殖活力和侵襲數目均顯著低于對照組，且青蒿素劑量越大，細胞增殖活力和侵襲數目越低。這就說明青蒿素對胃癌細胞的增殖和侵襲具有抑制作用且該抑制作用呈劑量依賴性的趨勢。

胃癌細胞的增殖是造成胃癌病灶生長、體積增大的重要病理環節，細胞周期進程的加速與細胞的增殖密切相關。CyclinD1是目前研究較為廣泛的細胞周期蛋白，主要作用于細胞周期G/S期的轉換并發揮正性調控作用[11-12]。CyclinD1與CDK4、CDK6形成復合體后能夠引起pRb發生磷酸化并釋放E2F，進而促進細胞周G1期進入S期。細胞周期G1期進入S期的加速能夠促進細胞增殖[13]。Ki-67是在細胞增殖細胞核中特異性表達的分子，能夠識別細胞周期中核抗原上的決定簇，Ki-67的表達量能夠反映細胞周期進展的速度以及細胞增殖的活力[14-15]。本研究通過分析不同劑量青蒿素處理對胃癌細胞中上述增殖基因表達的影響，發現不同劑量青蒿素組細胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達量均顯著低于對照組，且青蒿素劑量越大，細胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達量越低。這就說明青蒿素對胃癌細胞中增殖基因的表達具有抑制作用且該抑制作用呈劑量依賴性的趨勢。

胃癌細胞的侵襲是造成胃癌病灶向臨近組織浸潤、向遠處組織浸潤的重要病理環節，細胞外基質及細胞基底膜的降解與細胞的侵襲密切相關。MMPs是目前已知對多種蛋白質具有降解作用的一族鋅離子依賴性蛋白水解酶。MMPs家族中的MMP2和MMP9對細胞外基質及細胞基底膜中的膠原蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等多種成分具有降解作用，是細胞中重要的促侵襲基因[16-17]。胃癌病灶中高表達的MMP2和MMP9能夠通過降解細胞外基質及細胞基底膜中的多種成分來促進細胞侵襲[18-19]。在局部組織中，MMP2和MMP9的活性受到TIMP1和TIMP2的抑制，TIMP1和TIMP2也是細胞中重要的侵襲抑制基因[20]。本研究通過分析不同劑量青蒿素處理對胃癌細胞中上述增殖基因表達的影響，發現不同劑量青蒿素組細胞中MMP2、MMP9的mRNA表達量均顯著低于對照組，TIMP1、TIMP2的mRNA表達顯著高于對照組，且青蒿素劑量越大，細胞中MMP2、MMP9的mRNA表達量越低，TIMP1、TIMP2的mRNA表達量越高。這就說明青蒿素對胃癌細胞中促侵襲基因的表達具有抑制作用，對侵襲抑制基因的表達具有促進作用，且該調節作用呈劑量依賴性。

綜上所述，青蒿素能夠抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，抑制細胞周期蛋白及基質金屬蛋白酶的表達，是青蒿素發揮調節作用的分子機制。

[參考文獻]

[1] Jomrich G，Schoppmann SF. Targeted therapy in gastric cancer [J]. Eur Surg，2016，48（5）：278-284.

[2] Shi WJ，Gao JB. Molecular mechanisms of chemoresistance in gastric cancer [J]. World J Gastrointest Oncol，2016，8（9）：673-681.

[3] Jia J，Qin Y，Zhang L，et al. Artemisinin inhibits gallbladder cancer cell lines through triggering cell cycle arrest and apoptosis [J]. Mol Med Rep，2016，13（5）：4461-4468.

[4] Mondal A，Chatterji U. Artemisinin represses telomerase subunits and induces apoptosis in HPV-39 infected human cervical cancer cells [J]. J Cell Biochem，2015，116（9）：1968-1981.

[5] Zhang YJ，Zhan X，Wang L，et al. pH-responsive artemisinin dimer in lipid nanoparticles are effective against human breast cancer in a xenograft model [J]. J Pharm Sci，2015， 104（5）：1815-1824.

[6] Abdelfatah E，Kerner Z，Nanda N，et al. Epigenetic therapy in gastrointestinal cancer：the right combination [J]. Therap Adv Gastroenterol，2016，9（4）：560-579.

[7] Chang HR，Park HS，Ahn YZ，et al. Improving gastric cancer preclinical studies using diverse in vitro and in vivo model systems [J]. BMC Cancer，2016，9（16）：200.

[8] Zhou Y，Li W，Xiao Y. Profiling of multiple targets of artemisinin activated by hemin in cancer cell proteome [J]. ACS Chem Biol，2016，11（4）：882-888.

[9] Ooko E，Saeed ME，Kadioglu O，et al. Artemisinin derivatives induce iron-dependent cell death（ferroptosis）in tumor cells [J]. Phytomedicine，2015，22（11）：1045-1054.

[10] 吳孟軒.青蒿素和順鉑聯合干預對胃癌MGC-803細胞株上皮間質轉化、血管新生及ATP生成的影響[J].海南醫學院學報，2016，22（18）：2073-2076.

[11] 王軍，趙醒，趙宇陽，等.CyclinD1、CDC25B和p27在胃癌組織中的表達[J].廣東醫學，2016，37（10）：1495-1498.

[12] Matsuhashi N，Takahashi T，Yamaguchi K，et al. The significant role of Cyclin D1 in the synergistic growth-inhibitory effect of combined therapy of Vandetanib with 5-Fluorouracil for gastric cancer [J]. Anticancer Res，2016，36（10）：5215-5226.

[13] Kumari S，Puneet，Prasad SB，et al. Cyclin D1 and Cyclin E2 are differentially expressed in gastric cancer [J]. Med Oncol，2016，33（5）：40.

[14] 陳超，姚莉敏.胃癌中β-catenin、ki-67和Her-2/Neu表達及對胃癌侵襲、轉移的影響[J].重慶醫學，2016，45（18）：2504-2507.

[15] Bger C，Behrens HM，Rcken C. Ki67——An unsuitable marker of gastric cancer prognosis unmasks intratumoral heterogeneity [J]. J Surg Oncol，2016，113（1）：46-54.

[16] 李波，周爛.血清VEGF、MMP及MK與胃癌術后復發轉移的關系研究[J].海南醫學院學報，2016，22（9）：928-930.

[17] Bornschein J，Seidel T，Langner C，et al. MMP2 and MMP7 at the invasive front of gastric cancer are not associated with mTOR expression [J]. Diagn Pathol，2015，12（10）：212.

[18] Kim TH，Jung JY，Roh HJ，et al. Comparative expression of matrix metalloproteinases in internal malignancies and paired cutaneous metastatic lesions [J]. Am J Dermato-pathol，2015，37（5）：381-388.

[19] Verma S，Kesh K，Gupta A，et al. An overview of matrix metalloproteinase 9 polymorphism and gastric cancer risk [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（17）：7393-7400.

[20] Gurgel DC，Valenca-Junior JT，Dornelas CA，et al. Immunoexpression of metalloproteinases 2 and 14 and TIMP-2 inhibitor in main types of primary gastric carcinomas and lymph node metastasis [J]. Pathol Oncol Res，2015，21（1）：73-81.

（收稿日期：2017-02-27 本文編輯：張瑜杰）