高齡老年人牙髓干細胞分離培養(yǎng)與生物學特性分析實例報告

喬朋艷劉洪臣

·論著·

高齡老年人牙髓干細胞分離培養(yǎng)與生物學特性分析實例報告

喬朋艷劉洪臣

目的：對高齡老年人牙髓干細胞進行分離培養(yǎng)，探討其生物學特性。方法：應(yīng)用聯(lián)合酶消化法，分離培養(yǎng)一例88歲老年男性患者右上第三磨牙的牙髓細胞，進行原代培養(yǎng)并傳代，流式分析鑒定，體外培養(yǎng)觀察細胞的形態(tài)、增殖、分化能力。結(jié)果：首次成功分離培養(yǎng)高齡老年人牙髓干細胞；倒置相差顯微鏡下可見細胞透亮，呈長梭形；流式細胞學分析顯示，體外培養(yǎng)的老年人牙髓干細胞陽性表達間充質(zhì)干細胞標記CD73、CD90、CD105，不表達造血干細胞和內(nèi)皮細胞標記CD14、CD19、CD34、CD45及HLA-DR；細胞活力良好，可成骨向分化。結(jié)論：高齡老年人牙髓組織中存在牙髓干細胞，活力良好，具有一定的分化潛能。

牙髓干細胞；再生醫(yī)學；組織工程；高齡老年人；高齡老年人牙髓干細胞

老年人因牙周病、外傷、腫瘤以及系統(tǒng)性疾病所致牙頜面缺損的人群患病率高[1，2]，剩余骨量不足、骨質(zhì)不佳，嚴重影響其種植修復(fù)與功能重建[3]，干細胞介導(dǎo)的種植區(qū)骨增量與骨結(jié)合為重點探討的問題，獲得生物學性能良好的自體種子干細胞一直為國內(nèi)外研究的熱點[4]。

美國學者Gronthos等，于2000年首次發(fā)現(xiàn)和命名人牙髓干細胞(Dental pulp stem cells，DPSCs)[5]，這是一類存在于人體牙髓組織中具有較強自我更新和多向分化潛能的未分化細胞或前體細胞，屬間充質(zhì)干細胞，在合適的體內(nèi)或體外環(huán)境下可分化為多種人體細胞，為組織、器官修復(fù)和自體、異體移植的細胞治療等提供細胞來源[6-9]。

研究發(fā)現(xiàn)，牙髓干細胞取材方便、易于獲得和保存，其增殖和分化能力優(yōu)于自體骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow stem cells，BMSCs)[8,10-12]。但也有研究顯示：不同年齡、來源及代數(shù)的干細胞生物學活性或有差異[13,14]；對干細胞基因組、端粒、細胞周期抑制因子、線粒體等相關(guān)分子機制的研究表明，干細胞亦存在增齡性功能下降，表現(xiàn)為干細胞數(shù)量的減少和分化方向的改變[15]。本課題組前期研究亦證實，人骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和成骨分化能力隨年齡的增加而顯著下降，成脂分化能力增強，但因胚層起源不同其活性及受年齡影響的程度存在差異：老年人頜骨來源的骨髓間充質(zhì)干細胞，來自外胚層神經(jīng)嵴，其增殖和成骨分化特性優(yōu)于四肢骨來源的骨髓間充質(zhì)干細胞[14]，可修復(fù)下頜骨臨界骨缺損。因此，保持干細胞的活力、延緩干細胞衰老及延長干細胞的壽命具有重要意義。牙髓干細胞的數(shù)量和生物學特性隨年齡變化的規(guī)律是什么，高齡老年人牙髓干細胞可否作為組織再生修復(fù)的種子細胞，國內(nèi)外尚未見研究報道。因此，本研究擬分離培養(yǎng)高齡老年人牙髓干細胞(Geriatric dental pulp stem cells,GDPSCs)，觀察細胞的形態(tài)、增殖、分化等生物學特性，探索其未來在臨床應(yīng)用的可能性。

1.材料與方法

1.1 離體牙收集經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，臨床搜集1例88歲老年男性患者右上第三磨牙，牙齒拔出后，立即放入預(yù)冷含2倍培養(yǎng)濃度雙抗(100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素)的α-MEM培養(yǎng)基中(Invitogen，美國)。

1.2 原代細胞培養(yǎng)無菌條件下劈開牙齒，取出牙髓，切除根尖部約2 mm牙髓組織，0.01M的滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后剪成大小約1mm×1mm×1mm的組織塊，0.3%的I型膠原酶(Worthington Biochemical Corp.，美國)和0.4%的中性蛋白酶Dispase II(Sigma，美國)(1∶1)37℃消化1h，輕輕吹打離散單細胞團塊，將形成的單細胞懸液通過孔徑為70μm的細胞篩網(wǎng)，800r/min離心5min，將細胞沉淀用含20%胎牛血清(FBS，Invitogen，美國)+100U/ml青霉素+100mg/ml鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液重懸，以1×104-1×105/mL密度接種于5mL培養(yǎng)瓶(Corning，美國)中，置于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，24h首次換液，以后每3天換液。光鏡觀察分離培養(yǎng)的該例高齡老年人牙髓干細胞的細胞形態(tài)和生長情況，細胞生長達80%融合時，2.5g/L的胰酶(Invitogen，美國)消化傳代。

1.3 流式分析鑒定選取生長狀態(tài)良好的P4代DPSCs，制備細胞濃度為1×106個/mL的細胞懸液，使用人間充質(zhì)干細胞表面標記檢測試劑盒(BD，美國)，按說明書要求，在標號為①-⑧的1.5 mL的EP管中，依次加樣如下：

①5μL CD90 FITC+100μL細胞懸液

②5μL CD44 PE+100μL細胞懸液

③5μLCD105PerCP-Cy5.5+100μL細胞懸液

④5μL CD73 APC+100μL細胞懸液

⑤100μL細胞懸液

⑥20μL Neg+20μL Pos isotype control cocktails+100μL細胞懸液

⑦20μL Neg+20μL Pos marker cocktails+ 100μL細胞懸液

⑧20μLPosmarker cocktail+5μLPEdrop in+ 100μL細胞懸液

室溫避光孵育30分鐘，用流式細胞儀檢測鑒定。

1.4 細胞活性分析取生長良好的P4代細胞，在96孔板中接種100μL濃度為2×104cells/ml細胞懸液，即2000個細胞/孔，每板設(shè)10個復(fù)孔(n=10)，共接種10塊96孔板，置于培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)，分別在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天觀察細胞增殖情況。使用CCK-8(Dojindo，日本)試劑盒檢測細胞的增殖特性，向每孔加入10μL CCK-8溶液，放回培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時，每孔取上清100μL放入一塊新的96孔板中，用酶標儀檢測450nm的吸光度值，繪制生長曲線，測定細胞增殖情況。

1.5 多向分化潛能①成骨向分化，選取生長狀態(tài)良好的P4代DPSCs，以2×105個/孔接種于六孔培養(yǎng)板里(n=4)，常規(guī)換液。待細胞達到約80%融合時，加入成骨誘導(dǎo)液(Cyagen Biosciences，Guangzhou China)，每3天換液，2周后終止誘導(dǎo)，茜素紅染色；②成脂向分化：選取生長狀態(tài)良好的P4代DPSCs，以2×105個/孔接種于六孔培養(yǎng)板里(n=4)，常規(guī)換液。待細胞達到約100%融合時，加入成脂誘導(dǎo)液(Cyagen Biosciences，Guangzhou China)，首先使用A液誘導(dǎo)3天，換B液誘導(dǎo)1天，如此A液和B液交替作用，3周后終止誘導(dǎo)，油紅-O染色。

2.結(jié)果

2.1 細胞原代培養(yǎng)及傳代聯(lián)合酶消化法獲取的該例高齡老年人牙髓干細胞，在轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶培養(yǎng)24小時后首次換液，即可見細胞貼壁，但數(shù)量較少，呈現(xiàn)克隆式貼壁生長。培養(yǎng)的原代細胞(P0)生長達80%融合的時間約為10天，1瓶傳3瓶培養(yǎng)，至P1細胞生長再次達80%融合的時間則為3-4天，細胞透亮、形態(tài)為長梭形，圖1為傳代培養(yǎng)的P1、P4代DPSCs。

圖1 分離培養(yǎng)的DPSCs，A：P1代，B：P4代

2.2 流式分析鑒定流式細胞學分析顯示，體外培養(yǎng)的該例高齡老年人牙髓干細胞陽性表達間充質(zhì)干細胞標記CD73、CD90、CD105，不表達造血干細胞和內(nèi)皮細胞標記CD14、CD19、CD34、CD45及HLA-DR(圖2)。

圖2 DPSCs流式分析鑒定結(jié)果

2.3 細胞活性分析使用CCK-8檢測結(jié)果顯示，在接種后的1-2天為生長遲滯期，3-7天進入對數(shù)生長期，7天達到平臺期，9天之后開始進入衰退期(圖3)。

圖3 CCK-8檢測細胞活力結(jié)果

2.4 分化能力觀察

2.4.1 成骨向分化經(jīng)過2周的體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，使用茜素紅染色，肉眼可見鈣化，光鏡觀察可見鈣結(jié)節(jié)形成(圖4、5)。

圖4 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，茜素紅染色，肉眼觀察

2.4.2 成脂向分化經(jīng)過3周的體外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，使用油紅-O染色，光鏡下觀察，見少量脂滴樣物質(zhì)形成(圖6)。

圖5 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，茜素紅染色，光鏡下觀察，可見鈣化結(jié)節(jié)形成(箭頭)

圖6 誘成脂導(dǎo)培養(yǎng)3周后，油紅-O染色，見少量脂滴樣物質(zhì)形成

3.討論

3.1 分離、培養(yǎng)及鑒定研究者一般從臨床拔除的智齒、正畸減數(shù)牙、無治療價值的牙周炎患牙、多生牙以及牙髓炎患牙拔除的牙髓組織中獲取人牙髓干細胞[6,7]。牙髓干細胞的分離培養(yǎng)主要有兩種方法：外植體法(the explant method，DPSC-OG)和牙髓組織酶消化法(the enzymatic digestion of pulp tissue method，DPSC-ED)[16]，本研究采用后者獲得研究所需牙髓干細胞，進行貼壁培養(yǎng)和擴增。使用細胞流式分析儀對CD73+、CD90+、CD105+、CD34-、CD45-、CD14-、CD19-和HLA-DR-等針對間充質(zhì)干細胞的特異性表面標志物進行鑒定[17]，結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的該例高齡老年人的牙髓細胞為間充質(zhì)干細胞(圖2)，間充質(zhì)干細胞主要表面標記物均在該牙髓干細胞上陽性表達，提示其擁有良好的增殖分化能力。

3.2 不同年齡來源牙髓干細胞的一般特性與對比分析研究表明，牙齒的年齡不同，所分離的牙髓干細胞展現(xiàn)的沿特定細胞系分化的特點和傾向或不同[13]；但最近有學者比較了年輕恒牙牙髓干細胞和乳牙牙髓干細胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs)，提示不同來源、不同年齡的牙齒來源干細胞(Dental stem cells，DSCs)在細胞形態(tài)、增值速度、細胞表面標志物的表達、分化潛能方面表現(xiàn)相似。恒牙牙髓干細胞和乳牙牙髓干細胞，從臨床應(yīng)用的角度來說，應(yīng)該是同等的機會[18]。許多使用恒牙牙髓干細胞與乳牙牙髓干細胞進行對比的體內(nèi)移植實驗研究，結(jié)果均顯示二者的效果相似；甚至有研究顯示，恒牙牙髓干細胞的體外可傳代次數(shù)更多，而其成骨能力等生物學特性不受影響[18]。Laino等研究了45歲人牙髓干細胞，其生物學性能仍良好[17]。Wu等比較了4-8歲、12-20歲、32-49歲及55-67等幾個年齡組的人牙髓干細胞的生物學特性，結(jié)果為，較其他組，55-67歲年齡組牙髓干細胞活性及分化能力部分減弱[19]，但并未見體內(nèi)實驗的進一步比較研究。本研究首次成功分離的該例高齡老年人牙髓干細胞活性檢測結(jié)果顯示，在接種后的1-2天為生長遲滯期，3-7天細胞進入對數(shù)生長期，7天達到高峰，之后處于平臺期，隨著細胞的繼續(xù)增殖出現(xiàn)接觸抑制，第9天進入衰退期(圖3)，符合一般細胞學的生長規(guī)律；體外誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果顯示出其一定的多向分化能力(圖4-6)。

3.3 牙髓干細胞的應(yīng)用研究牙髓干細胞目前被廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學研究。有學者預(yù)測，牙髓組織將成為整形外科、口腔及口腔頜面外科組織重建、器官修復(fù)和臨床疾病治療的重要干細胞來源[18,20]，拔除的第三磨牙、正畸減數(shù)牙、多生牙等將不再被視作醫(yī)療廢棄物[21-23]。目前，牙髓干細胞主要用于牙齒及頜骨組織、肌肉、骨骼系統(tǒng)組織的修復(fù)及再生研究，已有牙髓干細胞用于糖尿病所致嚴重肢體缺血壞死、骨壞死所致骨缺損、燒傷所致皮膚損傷的再生以及肝臟、神經(jīng)、骨骼肌肉、血管及皮膚再生的報道[24-27]，顯示出良好的應(yīng)用前景。

此外，牙髓干細胞或可用于一些系統(tǒng)性疾病的免疫調(diào)節(jié)治療。研究顯示，干細胞具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠通過誘導(dǎo)免疫耐受以及高表達調(diào)節(jié)性T細胞，降低炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的組織損傷，有利于損傷組織的恢復(fù)和預(yù)后改善[28]，牙髓干細胞現(xiàn)已被應(yīng)用于多種疾病的免疫調(diào)節(jié)治療，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥[29,30]等，受試對象在接受干細胞或其分泌物治療后，相關(guān)癥狀得以緩解。未來，2型糖尿病、類風濕性關(guān)節(jié)炎等亦有望通過牙髓干細胞進行治療[31,32]。研究發(fā)現(xiàn)，干細胞治療的免疫調(diào)節(jié)機制更宏觀和多元化，干細胞進入血液循環(huán)后會較快發(fā)生凋亡，凋亡過程中的干細胞與機體免疫系統(tǒng)相互作用，引發(fā)系列鏈狀反應(yīng)，細胞活性越好，與機體相互作用越強[29-32]。因此，活性更好的牙髓干細胞在上述疾病的治療中可發(fā)揮更大的作用。

綜上所述，分離培養(yǎng)的該例高齡老年人牙髓干細胞具備一定的增殖、分化潛能，尚需要進一步的體內(nèi)、外系統(tǒng)對照研究，并對老年人牙髓干細胞的活力、干細胞狀態(tài)相關(guān)分子(端粒酶活性、細胞周期抑制因子等)、多向分化能力及調(diào)控進行深入研究，為臨床獲取、存儲及調(diào)控老年人牙髓干細胞用于組織再生修復(fù)提供實驗依據(jù)。

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The preliminary research on geriatric dental pulp stem cells from an 88-year-old man

QIAO Peng-yan,LIU Hong-chen(Instituteof Stomatology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China)

Objective:To isolate and obtain dental pulp stem cells(DPSCs)from the oldest-old and explore their biological functions.Methods:The dental pulp cells from an 88-year-old male patient’s upper third molar were isolated using the enzymatic digestion ofpulp tissue method,cultured,passaged and analyzed byflow cytometry.Cell morphology,proliferation and differentiation ability were observed in vitro.Results:It is the first to successfully isolated,cultured and passaged the geriatric dental pulp stem cells(GDPSCs).The morphology of the cells were spindle or exhibited several pseudopods under inverted phase contrast microscope and were positive for human multipotent mesenchymal stromal cells(MSCs)surface markersCD73,CD90,and CD105,butnegative forCD14,CD19,CD34,CD45 and HLA-DR.These cellsalso exhibited good self-renewal abilityand multilineage differentiation potential.Conclusion:DPSCs can be isolated from the pulp tissues of the oldest-old and present well proliferation and differentiation potentials.

dental pulp stem cells;regenerative medicine;tissue engineering;oldest-old;geriatric dental pulp stem cells

R787

A

1672-2973(2017)04-0193-05

2017-04-10)

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃) (項目編號：2015AA033502)

喬朋艷解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學研究所博士后北京100853

劉洪臣通訊作者解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學研究所所長主任醫(yī)師教授北京100853