Wnt經典通路β-catenin過表達對人牙周膜干細胞增殖能力及成骨能力的影響

李影劉娜張維顧斌

Wnt經典通路β-catenin過表達對人牙周膜干細胞增殖能力及成骨能力的影響

李影劉娜張維顧斌

目的：探討Wnt經典通路β-連環蛋白(β-catenin)過表達對人牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)增殖能力及成骨能力的影響。方法：收集因治療需要拔除的健康前磨牙和第三磨牙8顆，分離、培養PDLSCs。通過構建慢病毒過表達載體，轉染β-catenin基因使實驗組過表達β-catenin。轉染后顯微鏡下觀察常規培養及成骨誘導7d后細胞形態；MTT測定轉染前后PDLSCs的增殖情況；實時定量PCR技術檢測淋巴增強因子-1(LEF1)、T淋巴細胞因子-4(TCF4)、Runt相關轉移因子-2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、人I型膠原蛋白-1(Colossians 1，COL-1)及P38絲裂原活化蛋白激酶(P38mitogen activated protein kinases,P38 MAPK)mRNA表達。成骨誘導7d后，提取RNA，檢測成骨相關基因Runx2、ALP、COL-1、P38 MAPK mRNA表達。結果：轉染后細胞表達綠色熒光(green fluorescent protein，GFP)。MTT結果示：β-catenin過表達組PDLSCs增殖能力較空轉染組增強。β-catenin過表達組LEF1表達水平顯著上升(P＜0.05)，TCF4表達水平無顯著性差異(P＞0.05)；與空轉染組相比β-catenin過表達組成骨誘導7d后Runx2、ALP、COL-1及P38表達水平顯著降低(P＜0.05)。結論：經典Wnt/β-catenin通路在PDLSCs增殖及成骨分化過程中發揮重要作用，核心蛋白β-catenin過表達可上調LEF1的表達促進PDLSCs的增殖能力，并可通過下調RUNX2、ALP、COL-1、P38的表達抑制其成骨能力。

PDLSCs；經典Wnt通路；β-catenin；增殖能力；成骨能力

干細胞是維持組織器官正常再生能力的重要基礎。2004年，Seo首次從牙周膜中分離出人牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)，其具有成體干細胞共有的特性，具有多向分化及自我更新能力，體內可形成牙周膜-牙骨質樣結構，是牙周組織再生修復的理想種子細胞[1]。最新的動物模型和小規模試點可行性研究表明，PDLSCs可以作為修復牙周組織缺損的種子細胞[2]。PDLSCs在牙周組織生理功能維持與病理損傷修復中的重要作用及其牙周再生方面潛在的巨大應用前景，為PDLSCs生物學及其相關研究提供了新的契機[3]。

大量研究表明經典Wnt/β-catenin信號通路在干細胞成骨分化過程中發揮重要作用[4-5]。本課題組前期針對PDLSCs進行了抑制β-catenin的相關研究，發現β-catenin siRNA可特異性抑制PDLSCs中β-catenin基因表達，并明顯抑制細胞增殖[7]。此外，本課題組前期研究發現，炎癥微環境作用下經典/非經典Wnt通路在PDLSCs成骨分化過程中均發揮重要作用，抑制β-catenin可在一定程度上激活非經典Wnt/Ca2+通路，從而促進干細胞的成骨分化。但是，β-catenin發揮在PDLSCs成骨分化過程中的具體作用機制尚未被闡明。

本研究構建經典Wnt信號通路核心蛋白β-catenin過表達載體，進一步深入研究Wnt經典通路β-catenin過表達對PDLSCs增殖能力及成骨能力的影響，以期通過對β-catenin的調控來增強PDLSCs的成骨能力,為牙周組織再生提供新思路，為PDLSCs的臨床應用奠定實驗基礎。

1.材料和方法

1.1 主要試劑和材料胎牛血清、α-minimum essential medium(α-MEM)培養基(Gibco，美國)；0.25%胰蛋白酶(Sigma，美國)；青鏈霉素(Gibco)；鏈霉素(Gibco)；慢病毒包裝體系(含293T細胞、轉染試劑)KLV3504、polybrene(北京英茂盛業公司)；實時定量PCR儀(IQ5，美國)；RNA抽提試劑盒及反轉錄試劑盒(Fermentas，美國)；反轉錄聚合酶鏈反應試劑盒(RR037A,Takara,日本)、實時定量PCR試劑盒(AQ131,全式金)、MTT試劑盒(Takara，日本)；β-catenin兔抗人單克隆抗體、羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋公司)；熒光顯微鏡(奧林巴斯)。

1.2 實驗方法本研究經中國人民解放軍總醫院倫理委員會批準(批準號：IACUC-2015048)，所有受試者均簽署了知情同意書。

1.2.1 離體牙樣本收集實驗所用離體牙均取自口腔頜面外科門診。正常牙周膜組織來源于8名20-30歲因正畸需要拔除無齲前磨牙及第三磨牙的患者，男女各半。所有納入個體均無系統性疾病及已知的可以影響牙周狀況的疾病，無吸煙史，近6個月無特殊服藥史。

1.2.2 牙周膜干細胞的體外培養PDLSCs的獲取遵循本實驗室前期的實驗步驟[4]。在超凈工作臺內將拔除后2小時內的牙齒經0.01mol/L PBS沖洗3-5次后，自牙冠至牙根方向單向刮取牙根中下1/3部分的牙周膜，修剪組織塊為1mm3大小，用0.25%EDTA-胰酶消化6min后，等量培養液終止消化，離心管內的組織離心800r/min，6min。棄上清后重懸并放置在6孔板中(含10% FBS、100單位/mL青霉素/鏈霉素的α-MEM培養基)。在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養5-8d，直至有細胞從組織塊邊緣爬出。細胞生長達約80%匯合時用胰酶消化傳代，標記為第一代。采用有限稀釋法克隆化培養分離人正常組織來源的PDLSCs，采用第3代細胞進行實驗。

1.2.3 細胞分組及轉染將牙周膜干細胞各分成3組：空白對照組-未經任何處理的PDLSCs；空轉染組-轉染空載質粒；β-catenin過表達組-轉染過表達β-catenin載體。各組樣本量為3。人β-catenin(NM_001098209)(Inovogen Tech公司)。將轉染試劑稀釋液(轉染試劑20μl,DMEM無血清培養基480μl),加入質粒DNA溶液(慢病毒載體5μg Polyfect-V,pH1載體3.75μg DMEM,pH2載體1.25μg,DMEM無血清培養基490μl)中，立刻充分混勻；室溫孵育轉染混合液15min；消化HEK293T細胞，用293T培養基制備成0.6×106/ml細胞懸液，將細胞懸液放入15ml離心管備用；將每1ml轉染混合液加入10ml細胞懸液(密度調整為2×105)，輕輕吹吸細胞混勻；將細胞懸液加入10cm培養皿，放入37℃培養24h；去除含有轉染試劑的培養基，用10ml病毒培養基換液；轉染后48h收集細胞培養上清。500g離心10min去除細胞碎片，即為病毒液；將PDLSCs調整2×105密度接種于6孔板，待細胞貼壁后換無雙抗的培養液(含10%FBS)至細胞密度達到60%左右進行轉染；將適量病毒液和polybrene用細胞培養基稀釋，加入細胞培養皿中；繼續培養24h，用新的完全培養基替換病毒感染液；病毒感染后48h在熒光顯微鏡下觀察，觀察轉染效果。

1.2.4 成骨誘導試驗將第p3代空轉染組及β-catenin過表達組的PDLSCs以2×106密度接種于6孔板，10%FBS的α-MEM 37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養24h-48h，待細胞伸展至70%匯合后換礦化誘導液(含5mmol/L β-甘油磷酸鈉，50mg/L維生素C,1×108mol/L地塞米松、10% FBS的α-MEM培養液)連續培養，隔4d換液，7d后收集細胞進行檢測。

1.2.5 實時定量PCR檢測分別提取常規培養條件及成骨誘導條件下轉染前后的RNA，并測定RNA濃度，分別反轉錄為cDNA。反轉錄所得cDNA采用Syber Green熒光定量PCR檢測試劑盒進行熒光定量PCR檢測，反應體系均為20μl。引物序列：GAPDH,上游引物:5′-TCTGACGAC TCTGCTTCACG-3′,下游引物:5′-TTCAGGG CATGTGTGATGCT-3′;LEF-1，上游引物:5′-GG CCCCTCCTACTCCAGTTA-3′，下游引物:5-TA GACATGCCTTGCTTGGGG-3′；TCF-4，上游引物:5′-ATGCATGGGATCATCGGACC-3′；下游引物:5′-GGTCAGCCAACTCGTCACAGTC-3′；Runx2，上游引物：5′-CCCGTGGCCTTCAAG GT-3′，下游引物：5′-CGTTACCCGCCATGACA GTA-3′；ALP,上游引物:5′-ATGTCAACCGA AACGCCTCAG-3′，下游引物:5′-ATGGCGGA GTCGAACATGGCA-3′；COL-1,上游引物：5′-GCAAGGTGTTGTGCGATGA-3′,下游引物：5′-TGGTCGGTGGGTGACTCTG-3′；

P38 MAPK,上游引物：5′-GAACAAGACC GTCTGGGAGGTGC-3′，下游引物：5′-TTGGC GTGAATGATGGACTGAAA-3′。反應條件:95℃變性3min,95℃30s,60℃1min,40個循環。IQ5型實時熒光定量PCR儀監測記錄數據，結果根據標準曲線由軟件自動計算后得出。為驗證該方法的重復性和擴增效率，本實驗進行三次重復。

1.3 統計學分析SPSS22.0統計軟件進行相關數據分析，計量資料采用均值±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。多組間比較采用卡方檢驗；以雙側P＜0.05為差異有統計學意義，P值進行Bonferroni校正。

2.結果

2.1 β-catenin慢病病毒過表達載體成功轉染至PDLSCs轉染6h后觀察空白對照組、空質粒轉染組、β-catenin過表達組的PDLSCs，鏡下觀察可見6孔板內PDLSCs空質粒轉染組及β-catenin過表達組均出現大量細胞凋亡，換為常規培養液后鏡下可兩組PDLSCs仍伸展貼壁，胞膜胞核清晰可見。轉染24h后熒光顯微鏡下觀察可見空質粒轉染組(圖1B)、β-catenin過表達組(圖1C) PDLSCs均顯示GFP綠色熒光，這表示已成功完成了β-catenin過表達轉染。

圖1 轉染6h后鏡下觀察細胞形態(×200)及轉染24h后熒光顯微鏡下觀察細胞核GFP注：β-catenin為核表達

2.2 常規培養條件下過表達β-catenin促進PDLSCs增殖常規培養條件下，我們采用MTT法對空轉染組及β-catenin過表達組進行連續8d的檢測，我們的檢測結果顯示：β-catenin過表達組細胞吸光值自第3d起與空質粒轉染組出現統計學差異，其顯增殖活性顯著高于空質粒轉染組(圖2A)。隨后為了進一步驗證過表達β-catenin對PDLSCs增殖能力的影響我們進一步進行基因水平的檢測。我們的研究結果顯示：β-catenin過表達組LEF1 mRNA表達水平較空轉染組顯著性升高(圖2B)，但兩組的TCF4 mRNA表達水平無顯著性差異(圖2C)。

圖2 PDLSCsMTT結果(OD值)及相關基因的表達水平檢測A.β-catenin空轉染組及β-連環蛋白過表達組的吸光度值。B.空轉染組及β-catenin過表達組LEF1 mRNA表達水平。C.空轉染組及β-catenin過表達組TCF4mRNA表達水平。與空轉染組相比*P＜0.05為具有統計學差異。

2.3 過表達β-catenin可抑制PDLSCs的成骨能力成骨誘導7d后采用實時定量PCR檢測成骨關鍵基因ALP、COL-1、P38 MAPK、Runx2 mRNA的表達水平。常規培養條件下，空轉染組ALP mRNA的表達量是β-catenin過表達組的1.15倍，成骨誘導后，空轉染組ALP mRNA的表達量顯著升高，而β-catenin過表達組有一定程度的降低，此時空轉染組ALP mRNA的表達量是β-catenin過表達組的4.53倍(圖3A)。COL-1是成骨相關標志蛋白，常規培養條件下，β-catenin過表達組COL-1 mRNA的表達量是空轉染組的2.57倍，成骨誘導后，空轉染組COL-1 mRNA表達量有一定程度的上升，而β-catenin過表達組表達量顯著性降低，空轉染組COL-1 mRNA的表達量是β-catenin過表達組的1.92倍(圖3B)。P38 MAPK信號通路在間充質干細胞向成骨細胞分化過程中發揮重要作用。常規培養條件下，β-catenin過表達組P38mRNA的表達量是空轉染組的1.58倍，成骨誘導后，空轉染組P38mRNA表達量有一定程度的上升，而β-catenin過表達組表達量有一定程度的降低，空轉染組P38 mRNA的表達量是β-catenin過表達組的1.51倍(圖3 C)。Runx2是成骨相關的關鍵基因，常規培養條件下，β-catenin過表達組Runx2 mRNA的表達量是空轉染組的2.73倍，成骨誘導后，空轉染組Runx2 mRNA表達量顯著性上升，而β-catenin過表達組表達量顯著性降低，空轉染組Runx2 mRNA的表達量是β-catenin過表達組的1.44倍(圖3 D)。

圖3 常規培養及成骨誘導7d Real Time PCR檢測結果常規培養及成骨誘導7d后ALP(A)、COL-1(B)、P38 MAPK(C)、Runx2(D)mRNA表達水平：空轉組成骨誘導前后對比，*P＜0.05；β-catenin過表達組成骨誘導前后相比，*P＜0.05；常規培養條件下，空轉染組與β-catenin過表達組相比，*P＜0.05；成骨誘導條件下，空轉染組與β-catenin過表達組相比，*P＜0.05。

3.討論

PDLSCs具有良好的增殖能力及多向分化潛能，可以分化為成牙骨質細胞、成纖維細胞、成骨細胞，是牙周組織再生的基礎。在牙周組織再生的臨床應用中具有廣闊的前景。大量研究表明，無論是體內或者體外實驗，成牙骨質細胞、成纖維細胞、成骨細胞都具備使牙周支持組織再生的能力[6-9]。傳統牙周治療方法并未取得理想的修復效果。現在很多研究都著眼于將PDLSCs與納米支架材料相結合，運用于牙周支持組織損傷的治療。

Wnt信號通路是在機體發育和干細胞分化中發揮重要作用的信號通路。根據是否依賴于β-catenin發揮作用，劃分為Wnt經典以及非經典Wnt/Ca2+信號通路。經典Wnt/β-catenin信號通路是調控細胞分化的重要通路，在細胞的成骨分化中發揮重要的作用[10]。在慢性炎癥微環境中非經典Wnt信號通路參與牙周膜干細胞的成骨分化[11]。本課題組前期研究結果表明：Wnt經典信號通路與PDLSCs的增殖能力密切相關，抑制Wnt經典信號通路核心蛋白β-catenin可顯著抑制PDLSCs的增殖能力[12]。成骨誘導條件下抑制β-catenin可有效的抑制PDLSCs的β-catenin，并可增強Wnt非經典信號通路核心蛋白NLK的表達水平，提高PDLSCs的成骨分化能力。

為了更好的研究Wnt/β-catenin信號通路對PDLSCs成骨能力的影響我們構建了β-catenin過表達載體，經過轉染條件的反復探索我們成功完成了細胞的轉染。轉染后細胞表達GFP，且轉染效率穩定可靠，這為后續研究奠定了基礎。常規培養條件下，PDLSCs MTT結果顯示：與空轉染組相比，β-catenin過表達組增殖能力增強，從第3天起出現統計學差異。TCF/LEF是一類有雙向調節功能的轉錄因子,與Groucho結合后可抑制基因的轉錄，結合β-catenin后則可以促進基因的轉錄。有文獻提示LEF1是Wnt信號通路中重要的核內轉錄因子屬于LEF/TCF家族，其通過募集β-catenin，形成β-catenin-LEF/TCF復合物激活下游靶基因，從而介導Wnt信號通路[13]。TCF4是此家族的重要成員，作為核內轉錄因子可攜帶上游信號分子β-catenin入核，啟動cyclin D1、c-myc等靶基因的表達，是核內基因調控的重要分子。qPCR結果顯示：β-catenin過表達組LEF1 mRNA表達水平為空轉染組的2.4倍，具有統計學差異。TCF4 mRNA表達水平較空轉染組無顯著性差異。我們推測β-catenin促進干細胞增殖可能與LEF1密切相關，可能與TCF4無直接聯系。

成骨誘導后，β-catenin過表達組RUNX2 mRNA表達水平較常規培養條件下有一定程度的下降。可能是因為β-catenin過表達抑制了PDLSCs的成骨能力。有研究表明Smad可上調成骨細胞特異性轉錄因子Runx2、Osx等的表達,從而增強成骨細胞ALP和OCN的表達。以促進成骨細胞的分化和成熟[14]。常規培養條件下，β-catenin過表達組Runx2的表達水平較空轉染組顯著性增加，這可能與Smad蛋白家族的高表達有關。β-catenin過表達，牙周膜干細胞大量增殖，會導致Smad蛋白水平顯著性增加，從而促進了與之協同作用的Runx2的表達水平顯著性增加。具體機制有待進一步探究。COL-1是成骨的標志蛋白。成骨誘導培養條件下，β-catenin過表達組COL-1 mRNA的表達水平降低，證實了β-catenin過表達可抑制PDLSCs的成骨分化能力。常規培養條件下COL-1 mRNA的表達水平顯著性增加，這可能是因為β-catenin過表達增強了PDLSCs的增殖能力，細胞大量增殖，分泌的細胞外基質中COL-1水平顯著增加。ALP是成骨細胞的一種細胞表面標志性酶。對干細胞成骨誘導后,堿性磷酸酶表達有一定程度的增強。成骨誘導后，空轉染組的ALP mRNA的表達水平顯著性升高，β-catenin過表達組ALP mRNA表達水平顯著降低。這可能是因為高表達的β-catenin抑制了干細胞的成骨分化。P38 MAPK信號通路在間充質干細胞向成骨細胞分化過程中發揮重要作用。成骨誘導培養條件下，空轉染組的P38 mRNA的表達水平顯著性升高，β-catenin過表達組P38 mRNA表達水平顯著降低。大量研究結果表明，P38 MAPK可促進PDLSCs成骨能力，抑制P38 MAPK可降低其成骨能力[15-16]。P38 MAPK是干細胞成骨分化的重要標志，β-catenin過表達P38 mRNA表達水平顯著降低，表明β-catenin過表達抑制了PDLSCs的成骨分化能力。通過上述結果我們發現β-catenin過表達可抑制PDLSCs的成骨分化能力。

綜上，本研究結果表明在干細胞增殖及成骨分化過程中經典Wnt/β-catenin信號通路發揮關鍵作用，過表達β-catenin可增強PDLSCs的增殖能力，抑制PDLSCs的成骨分化能力。這為我們對PDLSCs的臨床應用的研究提供了新的實驗基礎。

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Effects of canonical Wnt/β-catenin over expression on proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells

LI Ying,LIU Na,ZHANG Wei,GU Bin(Department of Stomatology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853, China)

Objective:To construct Wnt/β-catenin gene overexpressed vector and to investigate the effects of its over expression on proliferation and osteogenic ability of human periodontal ligament stem cells.Methods:8 healthy premolars and third molars extracted for treatment were isolated and cultured for human healthy individuals(PDLSCs).Amplify the Wnt/β-catenin gene from PDLSCs,and cloned it into pLV-EGFP-Nvector,to construct Wnt/β-catenin overexpressed vector, then to transfect it into PDLSCs by lipofection method.Cell morphology was observed under fluorescent microscope after transfection of PDLSCs in conventional and osteogenic culture condition on the seventh day.We tested MTT results of PDLSCs.lymphoid enhancer factor-1(LEF1),T cell factor-4(LEF4),Runt-related transfer factor-2(Runx2),alkaline phosphatase(ALP),human type I collagen(COL-1)and P38 mitogen activated protein kinase(P38 MAPK)were detectedby real-time quantitative PCR.Results:GFP was expressed efficiently in PDLSCs after transfection.MTT results showed proliferation of PDLSCs after transfection was boosted specifically and efficiently than before.Real-time PCR results showed the expression of LEF1 mRNA was significantly increased than before,while there is no difference in TCF4. Simultaneously,Runx2,ALP,COL-1 and p38 were significantly decreased of PDLSCs transfected with Wnt/β-catenin overexpressed vector cultured in osteogenic differentiation condition.Conclusion:Classic Wnt/β-catenin pathway plays an important role in PDLSCs proliferation and osteogenic differentiation.OverexpressionofthecoreproteinWnt/β-catenin can upregulate the expression of LEF1,promote the proliferation of PDLSCs,and inhibit the osteogenic ability of PDLSCs by down regulating the expression of RUNX2,ALP,COL-1 and P38.

periodontal ligament stem cells(PDLSCs);canonical Wnt pathway;β-catennin;Proliferation;Osteogenic

R783

A

1672-2973(2017)04-0198-06

2017-03-20)

國家自然科學基金(項目編號：31670998；51473175)北京市科技新星計劃(項目編號：Z141107001814101)軍事口腔醫學國家重點實驗室開放課題(2014KA03)

李影解放軍總醫院口腔醫學研究所碩士生北京100853

劉娜解放軍總醫院口腔醫學研究所博士后北京100853

張維中國科學院理化技術研究所抗菌檢測中心北京100190

顧斌通訊作者解放軍總醫院口腔科副主任醫師北京100853