人脫落乳牙牙髓干細胞與牙髓干細胞生物學功能差異研究

龐真貞王良高磊劉欽贊李曄

人脫落乳牙牙髓干細胞與牙髓干細胞生物學功能差異研究

龐真貞王良高磊劉欽贊李曄

目的：從不同角度對人乳牙牙髓干細胞(SHED)與恒牙牙髓干細胞(DPSCs)的生物學功能進行對比研究，探討對骨改建的影響。方法：有限稀釋法分離培養SHED和DPSCs，成脂誘導14d進行油紅O染色、成骨誘導21d進行茜素紅染色；ELISA法檢測IL-6、TNF-α分泌水平；兩種干細胞常規培養及成骨誘導7d后進行ALP染色、實時定量PCR檢測Runx2、RANKL、OPG基因表達。結果：分離獲得的SHED和DPSCs具有成骨、成脂分化能力，符合干細胞特點。SHED的炎性細胞因子IL-6、TNF-α的表達均高于DPSCs(P＜0.01)；成骨誘導7d后SHED的ALP活性強于DPSCs(P＜0.05)；且經成骨誘導后兩種干細胞均表達Runx2、OPG和RANKL，但SHED的表達水平明顯高于DPSCs(P＜0.05)。結論：SHED與DPSCs相比不僅具有較強的成骨分化能力，而且兼具較強的破骨能力，提示SHED可能參與骨改建調控機制。

人脫落乳牙牙髓干細胞；牙髓干細胞；TL-6；Runx2

干細胞是指具有克隆形成能力的未分化細胞，有自我更新和多向分化的特點。目前，用于組織修復和再生的間充質干細胞(mesenchymal stemcells，MSC)多采用成體多能干細胞[1]。近年來，牙源性干細胞逐漸成為學者關注的熱點，Gronthos等[2]于2000年成功分離了人恒牙牙髓干細胞(Dental Pulp Stem Cells，DPSCs)，隨后，Miura等[3]從正常脫落的兒童乳牙中分離得到一種間充質干細胞[4]，并命名為人脫落乳牙牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)。二者皆具有成體干細胞的特性，細胞表面表達多種間充質干細胞特異性標記物且具有較強的增殖能力和多向分化潛能[5]。乳牙與恒牙在來源和成牙特性上相近，然而，在結構和組織學上有一定差異，近期有研究證實與DPSCs相比SHED增殖能力強，倍增時間短，且具有較高克隆形成能力及成骨分化能力[6]，但具體作用機制不清。本研究通過對比SHED和DPSCs的功能差異關鍵因子的分泌表達，為探討SHED有可能參與骨的改建調控機制提供實驗依據。

1.材料和方法

1.1 主要試劑和儀器胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、α-MEM培養基(Gbico，美國)、0.25%胰蛋白酶(上海雅心，中國)、青鏈霉素、鏈霉素(Gibco，美國)；RNA提取試劑盒、TNF-αElisa試劑盒(上海通蔚生)、逆轉錄試劑盒(Fermentas，美國)；TRIzol Reagent(Life Technologies，NY)；IL-6；ALP試劑盒(上海碧云天)；超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司，中國)；實時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國Life Technologies公司)。

1.2 收集樣本收集2014年12月至2015年2月保定市第一中心醫院口腔科5-7歲兒童，正常乳恒牙替換期自然脫落的乳牙樣本。脫落乳牙無明顯齲壞，牙髓病變及根尖周炎，根吸收達到牙根1/2-2/3，且所有納入個體均無系統性疾病。同期于口腔外科與正畸科收集18-25歲青年因埋伏阻生拔除的第三磨牙或因正畸治療拔除的前磨牙樣本。所取得恒牙均無明顯齲壞，牙髓病變及根尖周病變，且所有納入個體均無系統疾病。本研究經保定市第一中心醫院倫理委員會批準，且取得患者知情同意。

1.3 SHED和DPSCs的分離與培養在充分消毒乳、恒牙牙體周圍組織后拔牙，即刻置入預冷含高倍雙抗α-MEM培養基中，2h內原代取材。參照Gronthos2等的方法，在超凈工作臺中，PBS液反復沖洗牙齒，拔髓針直接拔取乳牙牙髓組織；用牙鉆從牙冠打開恒牙髓腔后，拔髓針拔取牙髓。用含有青、鏈霉素雙抗的0.1mL/L PBS反復沖洗，剪成約1mm3大小的組織塊，4%Ⅰ型膠原酶消化組織塊45min，加入含150mL/LFBS及含雙抗的DMEM培養液終止消化，1000r/min離心5min，棄上清，加入含20%胎牛血清的α-MEM培養液接種于35 mm培養皿中，常規培養2d后半量換液，之后每隔2-3d半量換液，待細胞量達80%-90%匯合時，按1∶3比例用胰酶消化傳代。應用有限稀釋法對SHED進行克隆分離：計數處于第一代對數期的SHED，有限稀釋至密度為約10個/mL，以100μl/孔接種于96孔培養板內，培養24h后，挑出單個細胞的孔繼續培養，每隔3d用含15%FBS的α-MEM培養液半量換液；待單克隆面積增至孔底60%以上時，消化法轉移至24孔板、6孔板中繼續擴大培養，逐步擴增至107數量級，以P3代細胞用于實驗。

1.4 成骨成脂分化取P3代的SHED和DPSCs計數后，以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，將其隨機分為實驗組與對照組，每組3孔。待細胞生長至60%-70%密度時將其進行成骨、成脂誘導。成骨分化：用含有地塞米松10μmol/L、β磷酸甘油鈉10mmol/L、vitC 50μmol/L、FBS 100mL/L的DMEM誘導液培養，每2-3d換液，21d后，40g/L的多聚甲醛固定1.5h，PBS液漂洗3遍，加入茜素紅37℃環境中染色30-45min，PBS沖洗后顯微鏡下觀察。成脂誘導：用含有地塞米松1μmol/L、IBMX 0.5μmol/L，胰島素10mg/L、吲哚美辛200μmol/L、FBS 100mg/L的DMEM誘導液誘導培養14d后，在顯微鏡下觀察胞漿內出現圓形空泡后，棄誘導液，PBS漂洗3遍將細胞用40g/L的多聚甲醛常溫固定30min。PBS漂洗3遍后，置于油紅O工作液中15-20min，蒸餾水沖洗5遍，鏡下觀察。

1.5 細胞因子檢測將第三代的SHED和DPSCs以1×105個/ml密度接種于24孔板中，分別設置4個副孔。待細胞貼壁后，棄原培養液，PBS沖洗3遍，將SHED及DPSCs加入含15%胎牛血清、0.292mg/ml谷氨酰胺、100μmol/L抗壞血酸、100U/ml青、鏈霉素雙抗的α-MEM培養基，24h后收集各個培養孔內的培養液進行離心，取上清液進行酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。分別按照IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒說明建立標準曲線后每孔加入100μl待測樣品，洗板，加入50μl一抗工作液，反應板充分混勻后置于37℃60min，洗板后加入100μl底物液，置于37℃避光保存10min，最后每孔加入終止液50μl混勻，在450nm處測吸光值。本實驗進行3次重復。

1.6 堿性磷酸酶染色將P3代SHED及DPSCs以1×104個/孔的密度接種于12孔板中，隨機分為實驗組與對照組，每組3孔。正常培養及成骨誘導，每3d換液培養至7d時，棄原培養液，PBS液沖洗3遍，4%多聚甲醛固定液固定30min。PBS液沖洗3遍，加入ALP染液37℃孵育45min。蒸餾水輕輕沖洗去染液，拍照。顯微鏡下觀察染色結果，呈藍色為陽性。

1.7 實時定量PCR將P3代SHED與DPSCs低密度接種于T25培養瓶內，在常規培養條件及成骨誘導條件下培養7d，后用Trizol裂解并提取成骨總RNA，逆轉錄為cDNA。采用SYBR Green試劑盒進行熒光定量PCR檢測，目的基因及管家基因在不同的反應管中進行擴增，反應體系20μl。反應條件：95℃變性20min，95℃30s，60℃1min，40個循環。采用實時熒光定量PCR儀監測記錄數據，結果根據標準曲線，軟件自動計算后得出。試驗重復3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統計學分析采用SPSS 19.0軟件對數據處理，比較兩組間的數據采用獨立樣本t檢驗。設P＜0.05表示差異有統計學意義。

2.結果

2.1 SHED與DPSCs均具有成脂、成骨分化能力經過低密度接種培養獲取的SHED和DPSCs具有干細胞的基本形態，細胞均成長梭形、胞漿均勻、核圓、核仁清晰，呈旋渦狀生長。SHED及DPSCs在向成骨方向誘導過程中，細胞形態發生了明顯變化，胞體增大，突觸消失，形態接近方形或多邊形，經成骨誘導21d后茜素紅染色呈陽性結果，可見礦化結節。SHED及DPSCs經成脂誘導培養14d后，胞漿內出現圓形空泡，并逐漸融合，油紅O染色可見呈紅色的脂滴顆粒(圖1)。這說明我們所分離培養的細胞符合SHED及DPSCs特性，為下一步實驗打下了基礎。

圖1 SHED和DPSCs成脂、成骨誘導分化(×200)

2.2 SHED和DPSCs TNF-α、IL-6分泌量及基因表達水平檢測TNF-α、IL-6在干細胞參與的骨改建過程中發揮一定作用，本研究首先采用Elisa方法檢測SHED及DPSCs TNF-α、IL-6分泌量，結果顯示，常規培養條件下SHED TNF-α、IL-6分泌量顯著高于DPSCs(P＜0.01)(圖2A)。實時定量PCR對TNF-α、IL-6在兩組細胞中表達的檢測結果與Elisa結果一致，SHED TNF-α、IL-6分泌量顯著高于DPSCs，其中SHED TNFα的表達水平是DPSCs的3.11倍(P＜0.01)(圖2B)。

圖2 A：ELISA檢測細胞因子分泌水平；B：SHED和DPSCs常規培養3d后提取RNA檢測炎癥相關基因表達*和DPSCs相比，P＜0.01

2.3 SHED和DPSCs成骨誘導7d后ALP染色將SHED和DPSCs成骨誘導7d后進行ALP染色，大體觀察可見SHED和DPSCs經成骨誘導后ALP染色較常規對照組有所增強。鏡下觀察，多數細胞質有藍紫色顆粒沉淀，且SHED較DPSCs染色深，由此可見SHED較DPSCs ALP陽性表達率高(圖3)。

圖3 SHED和DPSCs成骨誘導7d后ALP染色(100倍)

2.4 SHED與DPSCs經成骨誘導7d后關鍵基因表達檢測實時定量PCR結果顯示，SHED及DPSCs均表達成骨早期關鍵的轉錄因子基因Runx2。常規培養條件下SHED Runx2表達水平顯著高于DPSCs，成骨誘導7d后兩組細胞Runx2表達水平均顯著升高(P＜0.05)，SHED成骨誘導組表達值最高(圖4A)。常規條件下SHED和DPSCs OPG表達無顯著差異，成骨誘導后均顯著上調，成骨誘導后SHED OPG表達水平顯著高于DPSCs成骨誘導組(P＜0.05)(圖4B)。在RANKL表達上，成骨誘導7d后DPSCs較對SHED組降低，SHED增高4.37倍(P＜0.05)(圖4C)。

3.討論

兒童乳牙生理性根吸收是乳恒牙替換期的一種自然的生理現象，關于乳牙生理性根吸收的機制，有學者提出可能與炎癥環境、繼承恒牙萌出時的壓力或咬合創傷有關，但目前均處于探索階段?，F階段對根吸收的研究大多傾向于乳牙自身相關組織，因此乳牙牙髓干細胞成為當前的研究熱點。

圖4 SHED和DPSCs成骨、破骨相關基因表達*和DPSCs相比，P＜0.05

有研究表明，乳牙的生理性根吸收過程與骨重塑的過程相似。本實驗選用Runx2及OPG兩種成骨方向分化相關的特異性基因視為向成骨細胞分化的檢測指標[7]，檢測結果示，成骨誘導后，SHED和DPSCs的成骨相關基因Runx2和OPG表達量均較正常培養組有所提高，且SHED的Runx2和OPG表達增加量均明顯高于DPSCs，本實驗結果也再次驗證SHED較DPSCs具有更強的成骨分化能力[8-9]。

TNF-α為TNF家族重要成員之一，是目前公認的最重要的一個內源性誘生型促炎細胞因子，現有研究結果顯示，炎性因子能夠影響成骨細胞特異性基因的表達、細胞外基質的分泌以及成骨細胞的凋亡，且對破骨細胞的形成和活性具有重要的調節作用[10，11]。有實驗表明，TNF也可以刺激基質成骨樣細胞合成IL-6、PTHrp以及RANKL表達促進破骨細胞發育。本實驗的研究結果顯示，常規培養的DPSCs炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌量明顯小于SHED,且在炎癥相關基因的表達倍數上更是小于SHED。在骨的重塑過程中涉及經典的RANK/RANKL/OPG(核因子κB受體活化劑/ RANK配體/骨保護素)受體配體系統，在骨質代謝中發揮重要作用，且OPG和RANKL分別是破骨發生抑制因子與促進因子，RANKL與OPG的比值在破骨細胞分化成熟過程中有著重要作用[12]。RANK作為RANKL的受體，當RANKL與RANK結合后，啟動傳遞破骨細胞分化信號，使破骨細胞前體細胞開始增殖、分化以及細胞融合，形成破骨細胞，從而促進骨質吸收；然而當RANKL的另一種受體OPG與RANKL結合后，會對破骨細胞的功能產生抑制作用，同時也會抑制破骨細胞前體細胞的進一步發育，從而抑制骨質的吸收。在本實驗中，SHED與DPSCs均表達RANKL和OPG，但SHED在破骨相關基因RANKL的表達上呈上調趨勢，且明顯高于DPSCs。結果提示SHED相較于DPSCs具有更強的破骨能力。因此，本實驗結果表明，與DPSCs相比，SHED不僅具有更強的成骨分化能力，還兼有一定的破骨能力。但其具體的調節機制尚不清楚，還需進一步研究。

[1]Gregorio Laino,Antonio Graziano,Riccardo d'Aquino,et al. An approachable human adult stem cell source for hard-tissue engineering[J].J Cell Physio,2005,206(3):693-701

[2]Gronthos S,Mankani M,Brahim J,et al.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(25):13625-13630

[3]Miura M,Gronthos S,Zhao M,et al.SHED:stem cells from human exfoliated deciduousteeth[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(10):5807-5812

[4]Junjun Liu,Fang Yu,Yao Sun,et al.Concise Reviews: Characteristics and Potential Applications of Human Dental Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells[J].St em Cells, 2015,33(3):627-638

[5]Vishwanath VR,Nadig RR,Nadig R,et al.Differentiation ofisolated and characterized human dental pulp stem cells and stem cells from human exfoliated deciduous teeth:An in vitro study[J].J Conserv Dent,2013,16(5):423-428

[6]Heng BC,Zhu S,Xu J,et al.Effects of decellularized matrices derived from periodontal ligament stem cells and SHED on the adhesion,proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in vitro[J].Tissue Cell,2016,48 (2):133-143

[7]Francesca Paino,Marcella Noce,Virginia Tirino,et al.Histone Deacetylase Inhibition with Valproic Acid Downregulates Osteocalcin Gene Expression in Human Dental Pulp Stem Cells and Osteoblasts:Evidence for HDAC2 Involvement[J]. Stem Cells,2014,32(1):279-289

[8]Zhu Y,Shang L,Chen X,et al.Deciduous dental pulp stem cells are involved in osteoclastogenesis during physiologic root resorption[J].J Cell Physiol,2013,228(1):207-215

[9]Bei Li,Yu Zhang,Qingchao Wang,et al.Periodontal Ligament Stem Cells Modulate Root Resorption of Human Primary Teeth via Runx2 Regulating RANKL/OPG System[J].Stem cells and development,2014,23(20):2524-2534

[10]de Araújo Júnior RF,Souza TO,de Medeiros CA,et al. Carvedilol decrease IL-1β and TNF-α,inhibits MMP-2, MMP-9,COX-2,and RANKL expression,and up-regulates OPG in a rat model of periodontitis[J].Plos One,2013,8(7): e66391-e66391

[11]吳瑩瑩,劉洪臣.TNF-α、IL-1β及IL-6與糖尿病及牙周炎之間的關系[J].中華老年口腔醫學雜志，2011，9(2)：117-121

[12]Martin TJ.Historically significant eventsin the discovery of RANK/RANKL/OPG[J].World J Orthop,2013,4(4):186-197

Research differences of biological functions between stem cells from human exfoliated deciduous teeth and dental pulp stem cells

PANG Zhen-zhen,WANG Liang,GAO Lei,Liu Qin-zan,LI Ye(Department of Stomatology,Baoding First Central Hospital,Hebei 071000,China)

Objective:Research differences of biological functions between stem cells from human exfoliated deciduous teeth and dental pulp stem cells from different angles,to explore the influence of bone reconstruction.Methods:SHED and DPSCs were isolated,purified and cultured in vitro by limiting diluction,and oil red O staining at 14 days of adipogenic induction,alizarin red staining at 21 days of osteogenic induction;detect IL-6 and TNF-α secretion level by Elisa method; ALP staining at 7 days of two kinds of stem cells in conventional cultivation and osteogenic induced,and detect Runx2、RANKL and OPG gene expression by real-time PCR.Results:Both of SHED and DPSCs have abilty to adipogenic and osteogenic differentiation;conforms to the characteristics of the stem cells.SHED expression of IL-6 and TNF-α were higher than that of DPSCs(P＜0.05);Both kinds of stem cells express Runx2 OPG and RANKL after osteoinductive differentiation, but the expression of SHED obviously higher than that of DPSCs(P＜0.05).Conclusion:Compared with DPSCs,SHED has not only the ability of osteogenic differentiation but also an osteoclast capacity,remind that SHED may participate in the bone reconstruction.

human exfoliated deciduous dental pulp stem cells;dental pulp stem cells;TL-6；Runx2

R781

A

1672-2973(2017)04-0204-05

2017-02-23)

龐真貞保定市第一中心醫院口腔科主治醫師河北071000

王良保定市第一中心醫院手術室護師河北071000

高磊保定市第一中心醫院彩超室副主任醫師河北071000

劉欽贊保定市第一中心醫院口腔科醫師河北071000

李曄保定市第一中心醫院口腔科主任醫師河北071000