南方典型旅游城市空氣微生物特征研究

方治國,黃 闖,樓秀芹,李睿哲,姚文沖

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南方典型旅游城市空氣微生物特征研究

方治國1*,黃 闖1,樓秀芹2,李睿哲1,姚文沖1

(1.浙江工商大學環境科學與工程學院,浙江杭州 310018；2.杭州市疾病預防控制中心微生物檢驗科,浙江杭州 310021)

選取杭州市4個樣點進行了空氣微生物取樣,利用傳統可培養法系統研究了其空氣微生物特征.結果表明杭州市空氣微生物總濃度變化范圍為24~10135CFU/m3.均值為1140CFU/m3,空氣細菌濃度變化范圍為0~3253CFU/m3,均值為292CFU/m3,空氣真菌濃度變化范圍為0~8767CFU/m3,均值為848CFU/m3.空氣真菌濃度顯著高于細菌濃度.空氣細菌和真菌濃度百分比分別為29.1%和70.9%.杭州市不同樣點空氣微生物中濃度顯著不同,ZJGSUJC最高為1413CFU/m3,其次為YRBS(1174CFU/m3)和BLQG(1137CFU/m3), TJCR最低為834CFU/m3.杭州室外優勢細菌屬依次為微球菌屬()、芽孢桿菌屬()、葡萄球菌屬()、庫克菌屬()和假單胞菌屬(), 5屬細菌百分比總和約占55.26%~59.48%.優勢真菌屬依次為青霉屬()、枝孢屬()、鏈格孢屬()、無孢菌和曲霉屬(),分別約占總數的29.49%、21.43%、10.98%、10.88%和7.74%.本研究提供了杭州市空氣微生物污染的第一手資料,為城市管理部門制定相關的環境政策法規提供理論指導,也為全面掌握我國城市空氣微生物特征奠定基礎.

南方典型旅游城市；空氣微生物；生物氣溶膠；優勢菌屬；群落特征

空氣中廣泛分布的細菌、真菌孢子、放線菌和病毒等微生物粒子,不僅具有重要生態功能,而且還與空氣環境質量以及人類健康等密切相關[1-2].由生物粒子組成的氣溶膠,可間接作為云凝結核和冰核,導致云滴和冰晶的形成,在雨雪的形成過程中發揮著非常重要的功能,并且可通過直接散射或吸收太陽能輻射在全球氣候變化中起著至關重要的作用[3-5].然而,作為空氣污染表征體系的一部分,生物氣溶膠對評價空氣污染的致病性和過敏性具有重要的作用,小部分具有活性的生物氣溶膠能夠導致各種微生物疾病發生,比如結核病、細菌性肺炎、球孢子菌病、流行性感冒、胃腸道疾病和麻疹等[6].空氣中微生物的致病性是造成流行性疾病暴發的主要原因之一,它們往往比化學污染更加難以預防和控制[7].因此,空氣中生物污染物的種類、濃度及分布特征開始受到研究人員的高度重視.近年來流行性疾病的爆發更加讓我們意識到開展城市空氣微生物污染特征研究的重要性和緊迫性.

2001年,美國政府制定了生物監測計劃;2002年,Shelton等[8]報道了美國不同區域室內外空氣真菌的群落特征及濃度分布特點,2004年,美國科學家呼吁調查所有美國城市的空氣細菌群落以及利用基因芯片技術建立國家級空氣細菌數據庫[9].與國外相應的研究相比,我國城市空氣微生物的研究起步較晚.20世紀80年代末至90年代,胡慶軒等用自然沉降法調查了北京、天津和沈陽等地區的空氣生物污染特征[10-12].進入21世紀后,我國研究人員也意識到空氣微生物研究工作的重要性和緊迫性,對北京、廣州、南京、合肥等地區的空氣微生物進行了深入的研究[13-19].近年來,由于全國范圍內霧霾頻發,污染空氣中微生物群落特征及對人群健康的影響研究蓬勃發展,為特殊環境空氣微生物特征的研究打下了堅實的基礎.

杭州市是浙江省省會和全省經濟、文化和科教中心,長江三角洲中心城市之一,國家歷史文化名城和南方典型的風景旅游城市.杭州市空氣微生物的研究可以使我們更加深入了解其功能,并掌握其在提高生態系統功能中的作用.然而,有關杭州空氣微生物的研究工作至今仍為空白,論文以杭州市為例,通過定位觀測和系統取樣,研究了我國南方典型旅游城市空氣微生物群落結構及濃度變化特征,可為城市空氣微生物污染的控制和城市管理部門環境政策法規的制定提供理論指導.

1 材料與方法

1.1 研究樣點概況

在南方典型旅游城市浙江省杭州市選取4個不同的功能區,即文教區、交通樞紐、商業區和旅游風景區,試驗樣點分別設置在浙江工商大學教工路校區(ZJGUSJC)、天目山路與教工路口(TJCR)、延安路商業街(YRBS)和西湖曲院風荷(BLQG),于2011年6月~2012年5月進行空氣微生物特征研究,各樣點的基本概況如表1.

表1 取樣點基本概況

1.2 空氣微生物取樣器

采用國產Andersen生物粒子取樣器(FA-1,遼陽應用技術研究所)進行空氣微生物取樣測定.它是模擬人呼吸道的解剖結構和空氣動力學生理特征.采用慣性撞擊原理設計制造的.該取樣器分為6級,每級400個孔,從Ⅰ~Ⅵ級孔的直徑逐漸縮小,空氣流量為28.3L/min,每一級的空氣流速逐次增大,從而把空氣中的帶菌粒子按大小不同分別捕獲在各級培養皿上.取樣器按粒徑從大到小共分為6級為Ⅰ~Ⅵ級,其孔徑分別為1.18、0.91、0.71、0.53、0.34、0.25mm,粒子的捕集范圍分別為>8.2、5.0~10.4、3.0~6.0、2.0~3.5、1.0~2.0、<1.0μm,其有效截留粒子徑分別為8.2、6.0、3.0、2.0、1.0、0.65μm.

1.3 取樣和培養方法

選擇相同的天氣條件進行空氣微生物的取樣工作,實驗過程中每月取樣1次,每次連續取樣3d,每天取樣3次(9:00、13:00、17:00),每次3個重復.空氣微生物的取樣高度為人呼吸帶,距離地面約1.5m處.采樣器各層的孔眼至采樣面的距離(即撞擊距離)為2mm,室外空氣微生物的取樣時間為3min.取樣采用直徑為90mm的一次性塑料培養皿,預先在無菌條件下加入20~ 25mL已滅菌的微生物培養基,操作時盡量控制培養皿內培養基厚度的一致性,以減少試驗的系統誤差.空氣細菌取樣采用牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏5g,蛋白胨10g,氯化鈉5g,瓊脂15g,蒸餾水1000mL),采集的細菌樣品在37 ℃培養箱內培養48h;空氣真菌取樣采用沙氏培養基(葡萄糖40g,蛋白胨10g,瓊脂20g,蒸餾水1 000mL),加入氯霉素(0.05~0.125mg/mL)抑制細菌的生長,采集的真菌樣品在25℃培養箱內培養72h,然后分別在各級取樣培養皿上對微生物菌落進行記數、分離和純化.

1.4 空氣微生物濃度計算方法

由于通過Andersen 采樣器各篩孔的微生物粒子,超過一定數量后,會出現微生物粒子通過同一篩孔撞擊在同一點上的重疊現象,故各級采集的菌落數需經公式(1)校正:

式中:P為校正后的菌落數(i=1,2,3,4,5,6);為采樣器各級采樣孔數;為實際的菌落數.

空氣細菌濃度的計算方法見式(2)和(3):

BC=BC1+BC2+ BC3+ BC4+ BC5+ BC6(3)

式中:BC為空氣細菌總濃度,CFU/m3;BC(= 1,2,3,4,5,6)為取樣器各級空氣細菌濃度,CFU/m3; BP為取樣器各級校正后的細菌菌落數,個;為采樣時間,min;為空氣流量,L/min.

空氣真菌濃度的計算方法見式(4)和(5):

FC=FC1+ FC2+ FC3+ FC4+ FC5+ FC6(5)

式中:FC為空氣真菌總濃度,FC(=1,2,3,4,5,6)為取樣器各級空氣真菌濃度; FP為取樣器各級校正后的真菌菌落數;為采樣時間;為空氣流量.

空氣微生物濃度的計算方法如公式(6):

MC=BC+FC (6)

式中:MC為空氣微生物濃度,CFU/m3;BC為空氣細菌總濃度,CFU/m3;FC為空氣真菌總濃度, CFU/m3.

空氣細菌和真菌濃度百分比計算方法見式(7)和(8):

BC=BC/MC×100% (7)

FC=FC/MC×100% (8)

式中:BC為空氣細菌濃度百分比;FC為空氣真菌濃度百分比.

1.5 空氣微生物鑒定方法

1.5.1 空氣細菌鑒定方法 分離純化后的空氣細菌采用分子生物學方法進行鑒定,采用細菌16S rDNA通用引物PCR擴增,純化、送公司測序,再與NCBI數據庫比對獲得細菌相關菌種的信息,引物序列為:

27F: 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′,

1492R: 5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′.

1.5.2 空氣真菌鑒定方法 根據真菌菌落形態和顯微鏡下真菌的孢子特征把空氣真菌鑒定到屬.借鑒國外學者經驗,對在原培養基上培養3d未產生孢子的菌落如轉種培養2周后仍未見孢子生成,則列入無孢菌群,簡稱為無孢菌.分離純化后的空氣真菌采用分子生物學方法進行鑒定,采用真核生物核糖體基因(rDNA)內轉錄間隔區(ITS)通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增、純化、送公司測序,再與NCBI數據庫比對獲得真核生物相關信息,引物序列為:

F: ITS1 (5′- TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)

R: ITS4 (5′- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′).

1.6 統計分析和圖表制作方法

本研究數據分析和圖表繪制用SPSS Version 19.0和Microsoft Excel 2010 進行.

2 研究結果

2.1 杭州市空氣微生物濃度分布特征

杭州市空氣微生物、空氣細菌和空氣真菌的濃度均值分別為1140,292,848CFU/m3(表2),空氣真菌濃度約為空氣細菌濃度的2.9倍.從兩者的中值來看,空氣真菌濃度(550CFU/m3)約為空氣細菌濃度(201CFU/m3)的2.7倍.

表2 杭州市空氣微生物濃度特征(CFU/m3)

注:不同字母表示差異性顯著.

2.2 杭州市不同樣點空氣細菌和真菌濃度百分比

杭州市空氣細菌和真菌濃度分別占微生物總濃度的29.1%和70.9%(圖1),空氣細菌濃度百分比顯著低于空氣真菌(<0.01).從圖1可以得出,不同取樣點空氣細菌和真菌濃度百分比差異不同.BLQG空氣細菌和真菌濃度百分比差異最大,分別為21.0%和79.0%; YRBS差異最小,分別為41.1%和58.9%; ZJGSUJC分別為22.0%和78.0%,TJCR兩者濃度百分比分別為32.5%和67.5%.

圖中TJCR、ZJGUSJC、YRBS和BLQG分別為樣點天目山路與教工路口、浙江工商大學教工路校區、延安路商業街、西湖曲院風荷,Total為總體分布數據,下同

2.3 杭州市空氣微生物總濃度時空變化特征

2.3.1 不同取樣點空氣微生物總濃度 杭州市不同取樣點空氣微生物總濃度顯著不相同(圖2),ZJGSUJC的空氣微生物總濃度最高為1413CFU/m3,其次為YRBS和BLQG,兩者濃度分別為1174,1137CFU/m3,TJCR最低為834CFU/m3.

2.3.2 不同季節杭州市空氣微生物總濃度 杭州市空氣微生物季節變化特征顯著(圖3).從圖中可以看出,不同樣點冬季空氣微生物總濃度顯著低于其他季節(<0.01),4個取樣點TJCR、ZJGSUJC、YRBS、BLQG冬季空氣微生物濃度分別為497,575,669,573CFU/m3,沒有顯著差異. YRBS和TJCR空氣微生物濃度在秋季達到最高值,分別為1724,1100CFU/m3; ZJGSUJC和BLQG則在夏季達到最高值,分別為1764, 1394CFU/m3.

2.4 杭州市空氣微生物群落特征

在杭州市4個取樣點共分離鑒定出789株55屬184種空氣細菌,其中革蘭氏陽性菌和陰性菌分別占89.2%和10.8%.從鑒定出現頻率來看,優勢菌屬依次為微球菌屬()、芽孢桿菌屬()、葡萄球菌屬 ()、庫克菌屬 ()和假單胞菌屬 (),5屬細菌百分比總和約占55.26%~59.48%.在優勢菌屬中,微球菌屬約占總數的13.13%~18.45%,芽孢桿菌屬占11.17%~17.17%,葡萄球菌屬占10.68%~ 12.63%,庫克菌屬占9.47%~14.08%,假單胞菌屬占3.40%~6.57% (表3).

在分離純化的352株真菌中,共鑒定出21屬85種空氣真菌.從不同真菌屬濃度百分比看,杭州市優勢空氣真菌依次為青霉屬(),枝孢屬()、鏈格孢屬()、無孢菌和曲霉屬(),分別約占總數的29.49%、21.43%、10.98%、10.88%和7.74%.在分離純化的菌種中,青霉屬物種占有絕對的優勢,其出現的次數占分離菌株總數的36.5%(表3).

表3 杭州市不同樣點空氣微生物群落特征(%)

續表3

3 討論

在南方典型旅游城市杭州選取了4個樣點,系統研究了杭州市室外空氣微生物特征.結果發現,杭州市空氣中微生物、細菌和真菌濃度分別為1140,292,848CFU/m3,空氣中真菌濃度顯著高于空氣細菌(<0.01),真菌濃度約為細菌濃度的2.9倍.我國其他城市如廣州市空氣細菌和真菌濃度均值分別為1188,462CFU/m3[14],青島市春季和夏季空氣細菌和真菌濃度平均值約為439和524CFU/ m3[20],合肥市空氣中微生物、細菌和真菌濃度分別為54150、50400和3750CFU/ m3[21];而世界其他地區如法國馬賽城市空氣細菌和真菌濃度分別約為791,63CFU/m3[22],澳大利亞墨爾本空氣真菌濃度為1133CFU/m3.總體上說,杭州市室外空氣細菌濃度相對較低,這與杭州市的氣候特征及環境條件密切相關.圖4顯示了杭州和北京室內外空氣微生物濃度分布特征,從圖中可以看出,北京市室內外空氣微生物總濃度和細菌濃度均顯著高于杭州,而北京室內外空氣真菌濃度與杭州沒有顯著差異[16-19,23-26].分析其原因,可能是由于我國南北方城市不同的氣候特征及環境條件引起的.北京是我國典型的北方城市,首先其全年平均降雨量較少,空氣相對濕度較低,這樣空氣中的細菌粒子通過雨水的沖刷作用降落到地面的現象就會減弱,會導致近地面空氣細菌濃度增加;其次北京偶爾會有沙塵天氣,冬季室外風較大,容易引起地上粘附細菌的較大塵埃粒子漂浮在近地面的空氣中,這樣就能夠增加近地面空氣中的細菌濃度;再次北京晚秋到初春室外氣溫較低,相應的綠化植物覆蓋率相對較低,這樣就減少了植物揮發性分泌物對空氣中細菌的滅殺作用,引起空氣細菌濃度的總體增加.相反,杭州是我國典型的南方旅游城市,城市的整體綠化率很高,一年四季植被的覆蓋率都較高,整潔程度也較好,全年平均降雨量較高,空氣的相對濕度較大,而且沒有沙塵天氣,這些都是引起空氣細菌濃度降低的主要因素.對于空氣真菌而言,首先杭州的氣候條件(氣溫和濕度)非常適宜空氣中真菌的生存和繁殖,其次杭州的植被覆蓋率較高也是空氣真菌濃度較高的主要原因,因為綠色植物的葉原基可以作為空氣中真菌生長的天然培養基,導致空氣中真菌濃度的增加.而北京的氣候條件及綠色植物覆蓋率問題都是其空氣真菌濃度不高的關鍵因素[16-19,23-28].

杭州市不同樣點空氣細菌和真菌濃度百分比差異較大,BLQG空氣細菌和真菌濃度百分比分別為21.0%和79.0%,YRBS則分別為41.1%和58.9%,這主要是由于樣點之間較大的環境條件差異引起的.BLQG周邊植物覆蓋率很高,人流和車流相對較少,這會引起空氣中細菌濃度及其百分比的降低,相反YRBS植被覆蓋率較低,人流和車流較大,引起空氣中細菌濃度及其百分比的增加.相對于真菌而言,植被覆蓋率高能夠引起空氣中真菌濃度及百分比的增加.圖5顯示了杭州和北京室內外空氣細菌和真菌濃度百分比的差異,從圖中可以看出,北京室內空氣細菌和真菌的濃度百分比分別為59.0%和35.2%,室外則分別為61.0%和39.0%,室內外空氣細菌濃度百分比均顯著高于空氣真菌;而杭州室外空氣細菌和真菌濃度百分比則分別為29.1%和70.9%,空氣細菌濃度百分比顯著低于空氣真菌.杭州和北京空氣細菌和真菌濃度百分比差異巨大,主要是我國南北方城市氣候特征的巨大差異引起的[16-28].

杭州市不同取樣點空氣微生物總濃度顯著不相同,ZJGSUJC的空氣微生物總濃度最高為1413CFU/m3,其次為YRBS和BLQG,TJCR最低為834CFU/m3.這與我們以前北京的研究結果基本一致,在北京研究的3個樣點中,文教區的空氣微生物總濃度顯著高于交通干線和公園綠地,這是因為文教區如ZJGSUJC的環境條件空氣細菌和真菌濃度都較高,導致空氣微生物總濃度相對較高,而交通干線如TJCR的環境條件空氣真菌濃度較低,公園綠地如BLQG的環境條件空氣細菌濃度較低,這就導致了空氣微生物總濃度相對較低[16-19].此外,杭州市不同季節空氣微生物總濃度顯著不同,冬季空氣微生物總濃度均顯著低于其他季節,這可能是由于冬季氣溫較低,不適合空氣中微生物的生長和繁殖[16-19].

在杭州市4個取樣點優勢空氣細菌依次為微球菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、庫克菌屬和假單胞菌屬,5屬細菌約占55.26%~59.48%;優勢空氣真菌依次為青霉屬,枝孢屬、鏈格孢屬、無孢菌和曲霉屬,分別約占總數的29.49%、21.43%、10.98%、10.88%和7.74%.以上的研究結果與國內外其他城市或區域可培養空氣微生物的研究結果基本一致[8-31].對于空氣中的細菌而言,由于微球菌屬等革蘭氏陽性球菌所含有的胡蘿卜色素等和芽孢桿菌的孢子,可抵御日光輻射的滅殺作用[31].但科研人員在研究森林、海岸、城市和鄉村4個生態系統中空氣細菌發現,芽孢桿菌是最為優勢的菌屬,微球菌屬百分含量很低,葡萄球菌屬則沒有出現,這兩個均為非優勢菌屬[32].這可能與取樣環境密切相關,因為在干燥的環境條件下,那些能夠忍受干燥環境的孢子能夠萌發,而其它細菌粒子的活力就會比較差,這樣能夠顯著增加空氣中芽孢桿菌屬的菌種百分比[32].對于空氣中的真菌而言,研究發現北京市不同樣點空氣中枝孢屬濃度百分比最高,均占36.0%以上,青霉屬只占11.0%以上[33],而本研究杭州市不同樣點青霉屬和枝孢屬濃度百分比平均值分別為29.5%和21.4%,南北方城市真菌群落結構差異較大,這可能與我國南北方城市的氣候特征(如北方氣候干燥降雨較少,南方氣候濕潤降雨較多)和植被條件(城市綠化植物種類及植被覆蓋率等)密切相關.

4 結論

4.1 杭州市空氣真菌濃度 (292CFU/m3)顯著高于空氣細菌 (848CFU/m3),空氣細菌和真菌濃度分別占微生物總濃度的29.1%和70.9%.

4.2 杭州市空氣微生物總濃度時空變化特征顯著,ZJGSUJC空氣微生物總濃度最高(1413CFU/ m3),其次為YRBS (1174CFU/m3)和BLQG (1137CFU/m3),TJCR最低(834CFU/m3),各個樣點冬季空氣微生物總濃度顯著小于其他季節.

4.3 在4個樣點分離的789株空氣細菌中,革蘭氏陽性菌和陰性菌分別占89.2%和10.8%,優勢細菌屬依次為微球菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、庫克菌屬和假單胞菌屬,5屬細菌總和約占55.26%~59.48%.

4.4 在4個樣點分離純化的352株空氣真菌中,優勢真菌屬依次為青霉屬,枝孢屬、鏈格孢屬、無孢菌和曲霉屬,分別約占總數的29.49%、21.43%、10.98%、10.88%和7.74%.

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Characteristics of airborne microbes in typical tourist city in southeast China.

FANG Zhi-guo1*, HUANG Chuang1, LOU Xiu-qin2, LI Rui-zhe1, YAO Wen-chong1

(1.School of Environmental Science and Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310012, China；2.Microbiology Laboratory, Hangzhou Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310021, China)., 2017,37(8)：2840~2847

The characteristics of airborne microbes were carried out detailedly by culture-dependent method at four typical sampling sites in Hangzhou. Results showed that the concentration of total microbes, bacteria, and fungi ranged from 24 to 10135CFU/m3, 0to 3252CFU/m3, 0to 8767CFU/m3, respectively, and the mean concentration was 1140, 292, and 848CFU·m-3, respectively. In general, the concentration of airborne bacteria was significantly higher than that of airborne fungi, and the concentration percentage of airborne bacteria and fungi was 29.1 % and 70.9%, respectively. Significant difference of airborne microbes was observed at different sampling sites in Hangzhou, and the maximum concentration was found at ZJGSUJC (1413CFU/m3), followed by YRBS (1174CFU/m3) and BLQG (1137CFU/m3), with a minimum at TJCR (834CFU/m3). Amongst all the airborne bacteria,was the most dominant bacterial genus, followed by,,and, all of these five bacteria genera accounted for about 55.26% to 59.48% of total airborne bacteria. The predominant fungal genera were(29.49%),(21.43%),(10.98%), Mycelia sterilia (10.88%), and(7.74%), respectively. Results provide the first-hand information on airborne microbes in Hangzhou, and provide theoretical guidance for city management departments to develop relevant environmental policies and regulations, and also lay a foundation for the overall grasp of urban microbial characteristics in the air in China.

typical tourist city in southeast China；airborne microbe；bioaerosols；dominat bacteria and fungi；community characteristics

X513;X712

A

1000-6923(2017)08-2840-08

方治國(1977-),男,安徽黃山人,副教授,博士,主要從事空氣生物性污染方面的研究.發表論文50余篇.

2016-12-16

中國科學院生態環境研究中心城市與區域生態國家重點實驗室開放基金資助項目(SKLURE2015-2-1);浙江省自然科學基金資助項目(LY17D050006)

*責任作者, 副教授, zhgfang77@zjgsu.edu.cn