青島冬季霾天不同粒徑生物氣溶膠中細菌群落特征研究

馬曼曼,甄 毓*,米鐵柱,祁建華,邵聰聰,馮文榮

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青島冬季霾天不同粒徑生物氣溶膠中細菌群落特征研究

馬曼曼1,2,3,甄 毓1,2,3*,米鐵柱1,2,3,祁建華1,2,3,邵聰聰1,2,馮文榮1,2,3

(1.中國海洋大學環境科學與工程學院,山東青島 266100；2.海洋環境與生態教育部重點實驗室,山東青島 266100；3.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生態與環境科學功能實驗室,山東青島 266071)

采用Illumina高通量測序方法對青島冬季一次霾過程中大氣生物氣溶膠中細菌群落結構特征進行了研究.測序獲得的807104條序列以97%的相似水平可劃分為874個OTUs,其中有344個OTUs注釋到屬水平.結果表明,霾發生時,大氣生物氣溶膠中細菌群落結構和多樣性變化顯著.由非霾到重度霾天過程中,細菌群落豐富度和多樣性逐漸降低,且細菌群落豐富度在不同粒徑顆粒物上的差異逐漸減小,多樣性在不同粒徑顆粒物上的差異逐漸增大.非霾天優勢菌屬為假單胞菌屬()、韋榮氏球菌屬()和鞘氨醇單孢菌屬();霾發生后,優勢菌屬轉變為鞘氨醇單孢菌屬().此次霾發生過程中,濃度升高的鞘氨醇單孢菌屬()和新檢出的皮生球菌屬()、梭菌屬()、纖毛菌屬()、黃桿菌屬()為條件致病菌,可能存在健康風險.

霾；16S rRNA；細菌；群落結構；健康風險

生物氣溶膠來源于陸地或水生環境中各類生物活動所產生的各種大氣顆粒物[1],是大氣氣溶膠的重要組成部分,對空氣質量、人體健康、全球氣候變化都有著重要影響[2].空氣中的微生物可以菌團的形式黏附于不同粒徑的顆粒物,形成微生物氣溶膠[3].細菌是微生物氣溶膠的重要組成部分,在PM2.5和PM10的生物組分中,細菌的相對百分比可達80%以上[4].霾發生時,大氣細顆粒物濃度的升高為微生物提供了大量的附著介質[5],大氣中細菌的濃度與顆粒物濃度呈正相關[6].王偉等[7]對西安市秋季灰霾天氣微生物氣溶膠的特性研究表明,灰霾天期間,可培養細菌與真菌氣溶膠的濃度水平均遠高于非霾天微生物氣溶膠的濃度值,且出現了非霾天未鑒定出的致病菌擬青霉屬與頭孢霉屬種類.Cao等[4]對北京一次嚴重霧霾期間PM2.5和PM10中可吸入微生物的研究中共鑒別出1300多種微生物,發現了一些具有過敏性和致病性的呼吸道微生物序列,它們的相對豐度隨顆粒污染物濃度的增加而增加.Chandan等[8]從北京2013年1月份的14個霧霾樣本中檢測出大量抗生素耐藥性基因,其中包括碳青霉烯類抗生素的耐藥性基因.霾污染還可以引起空氣微生物群落結構的改變.武麗婧[9]對青島及黃海生物氣溶膠中微生物群落多樣性研究表明,霧、霾天氣下生物氣溶膠中微生物優勢菌發生變化,群落結構比晴朗天氣下更復雜,多樣性更高.可見,特殊天氣下生物氣溶膠的濃度、群落結構和優勢菌會發生很大變化.但關于特殊天氣下生物氣溶膠群落結構和組成粒徑變化的報道相對較少.因此,研究霾發生時不同粒徑生物氣溶膠中細菌群落結構的組成與變化對于全面了解生物氣溶膠的環境效應和人體健康效應均有重大意義.

16S rRNA占細菌RNA總量的80%以上,序列長度適中,是最常見的生物標志物,在微生物的分類、系統進化和多樣性研究中較為常見[10].基于16S rRNA基因的高通量測序分析可以在基因水平獲得生物氣溶膠中細菌的群落結構及多樣性特征,已被廣泛應用于大氣中細菌的研究[11-14].

近年來,青島地區霾污染頻發[15],為了解霾發生時微生物群落結構的變化及其對空氣質量和人體健康的影響,本研究通過采集青島冬季霾天與非霾天大氣生物氣溶膠樣品,提取細菌總DNA進行16S rRNA擴增子高通量測序分析,探討霾發生時不同粒徑細菌群落結構特征與變化,初步評估了霾發生時細菌對人體健康的潛在風險.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

表1 采樣期間嶗山地區實時氣象資料

采樣點位于中國海洋大學嶗山校區教學樓六區樓頂(圖1,36°09￠N,120°29￠E),距離地面高度9.0m,距海約7.0km,位置開闊,無人為污染源.采樣時間為2015年1月7~16日,采樣期間嶗山地區實時氣象資料見表1,其中1月7日空氣質量為良,1月15日為輕度霾天,1月16日為重度霾天(分別用FM、QM和ZM代表1月7日、1月15日和1月16日樣品).采用FA-1六級篩孔撞擊式空氣微生物采樣器(遼陽康潔儀器研究所)采樣30min.采樣器6個粒徑范圍分別為0.65~1.1μm、1.1~2.1μm、2.1~3.3μm、3.3~4.7μm、4.7~7.0μm和大于7.0μm(在本文討論中將這六級粒徑范圍分別用1~6級表示).采樣膜為0.22μm的聚碳酸酯膜(北京升河誠信膜科技發展有限公司).采樣器高度1.5m,流量28.3L/min.為防止污染,采樣前將所需的實驗用具在121℃條件下高溫高壓滅菌20min,烘干后置于超凈臺.采樣后,在超凈臺內使用一次性手套和潔凈的不銹鋼鑷子將采樣膜用滅菌烘干的鋁箔包好,-20℃保存.

1.2 樣品處理

1.2.1 細菌總DNA提取與檢測 將采樣膜用滅菌過的剪刀剪碎后置于1.5mL的離心管中,按照DNA提取試劑盒(QIAamp DNAMini Kit)的步驟進行細菌總DNA提取.提取的DNA溶解在100μL的Buffer AE(試劑盒提供)中.利用細菌16S rDNA引物338F和518R對提取的DNA進行PCR擴增,之后進行2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[9],能擴增出目的條帶的DNA即為檢測合格,可用于后續的高通量測序分析.將檢測合格的細菌總DNA樣本送至上海銳翌生物科技有限公司進行高通量測序.

1~6:1月7日6個粒徑空氣微生物,7~12:1月15日6個粒徑空氣微生物,13~18:1月16日6個粒徑空氣微生物,19~20:陰性對照

1.2.2 高通量測序 以樣品DNA作為PCR反應模板,擴增16S rRNA基因的V3-V4區.PCR反應正反向引物分別為5'-ACTCCTACGGGAG- GCAGCAG和5'-GGACTACHVGGGTWTCTA- AT[16-17].擴增后得到425bp的擴增片段,檢測合格后,添加測序接頭,選用MiSeq2′300測序平臺進行高通量測序.

1.3 數據處理

1.3.1 質量控制 利用Pandaseq[18]軟件(version 2.9)根據雙端測序序列的重疊關系將成對的reads拼接成一條序列,得到高變區的原始序列(raw reads).對拼接后的序列進行質控分析(去除平均質量低于20和含N堿基數超過3個的reads),獲得有效序列(clean reads).

1.3.2 OTUs和多樣性分析 將拼接的有效序列中的singletons過濾掉,利用Uparse[19]軟件(version 7.0.1001, http://drive5.com/uparse/)去除嵌合體,并在97%的相似度下對序列進行聚類,得到用于物種分類的OTUs.在保證測序深度足夠的前提下,對每個樣品進行均一化處理,以避免樣品數據大小不同而造成分析時的偏差.之后,對抽平后的序列聚類的OTUs進行核心微生物(core microbiome)分析、韋恩(Venn)分析和PCA分析.

1.3.3 群落結構組成和相似性分析 從OTUs中挑選出豐度最高的一條序列作為代表序列,與16S rDNA數據庫(Greengenes[20], http: //greengenes.lbl.gov)在90%的相似性下進行比對,從而對OTUs進行物種注釋,并根據每個OTU中序列的條數得到OTU分度表,對物種豐度和熱圖進行分析.利用QIIME軟件(version 1.9.0)計算Alpha多樣性指數和Beta多樣性指數,進行單個樣品復雜度和樣品間復雜度分析.

2 結果與討論

2.1 OTUs及多樣性分析

不同空氣質量下3組(共18個)不同粒徑樣品,經高通量測序后,將所得的原始數據進行拼接、質控和去除嵌合體,共得到807104條序列.根據Alpha多樣性指數稀釋曲線(圖3),隨機抽取27461條序列對每個樣品進行均一化處理,以97%的相似性水平可聚類為874個OTUs.OTUs數目最多的為非霾天的1.1~2.1μm粒徑樣品,有281個OTUs;最少的為非霾天的3.3~4.7μm粒徑樣品,含有76個OTUs(圖4).非霾天不同粒徑OTUs數目相差較大,表明非霾天不同粒徑下空氣微生物群落豐富度差異較大.霾天不同粒徑OTUs數目相差較小且在多個粒徑級別上均小于非霾天,表明霾發生時,空氣微生物群落豐富度減小,且不同粒徑下空氣微生物群落豐富度差異減.

FM1~FM6:1月7日6個粒徑空氣微生物;QM1~QM6:1月15日6個粒徑空氣微生物;ZM1~ZM6:1月16日6個粒徑空氣微生物.

1:0.65~1.1μm,2:1.1~2.1μm,3:2.1~3.3μm,4:3.3~4.7μm, 5:4.7~7.0μm,6:大于7.0μm

非霾天和霾天所有樣品共聚類為874個OTUs,其中非霾天和霾天共有88個OTUs(圖5),占OTUs總數的10.1%.非霾天獨有469個OTUs,輕度與重度霾天則各獨有73、54個OTUs,表明由非霾天到重度霾天的發展過程中有大量種類細菌因環境改變而減少或消失.非霾天與輕度霾天共有124個OTUs,與重度霾天共有121個OTUs,而輕度和重度霾天共有209個OTUs,可見非霾天與霾天細菌種類差別較大,而霾過程中細菌種類的相似性較高.

表2 非霾天與霾天各粒徑樣品Alpha多樣性指數

所有樣品的測序覆蓋度均在99.9%以上,測序深度基本覆蓋全部物種.由非霾天到重度霾天,樣品的Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數呈現逐漸減小的趨勢(表2),即隨著霾的加重,大氣細菌群落豐富度和多樣性逐漸降低.非霾天Chao1指數各粒徑差異較大(圖6a),而霾天各粒徑差異較小,表明霾的發生減小了大氣細菌群落豐富度的粒徑差異.Shannon指數(圖6b)和Simpson指數(圖6c)在非霾天各粒徑樣品中均呈現較高的水平,粒徑差異較小;而霾發生時, Shannon指數和Simpson指數的粒徑差異變大,表明霾的發生改變了細菌群落結構的粒徑差異.本結果與武麗婧[9]和邵聰聰等[21]運用變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)方法研究得出的青島霾天大氣細菌群落多樣性高于非霾天不一致,可能的原因是DGGE僅能對群落中的優勢微生物進行分析,而高通量測序方法則覆蓋度更廣,能較為全面的分析細菌群落結構[22-23].

根據對氣溶膠粗細粒子粒徑范圍的劃分[24]以及采樣器的粒徑切割范圍,將小于2.1μm的粒徑定義為細粒徑(1-2號粒徑),用f表示,大于2.1μm的粒徑定義為粗粒徑(3-6號粒徑),用c表示.由此可以發現(圖6d),由非霾天到重度霾天,粗細粒徑上的細菌群落豐富度和多樣性都降低.非霾天,粗細粒徑細菌群落多樣性均較高且差異不大.輕度霾天,細粒徑細菌群落多樣性高于粗粒徑,重度霾天細粒徑細菌群落多樣性低于粗粒徑,且輕度與重度霾天樣品多樣性指數在粗粒徑上變化不大,表明霾發生時,空氣微生物群落結構在粗粒徑上具有一定穩定性.Dong等[25]發現,霾發生時粗粒徑上空氣微生物樣品濃度變化不大,與本研究結果相似.

綜上,由非霾天到重度霾天,大氣細菌群落結構發生變化,群落豐富度和多樣性逐漸降低.同時,霾的發生改變了空氣細菌群落結構的粒徑差異.霾過程中,微生物群落豐富度的粒徑差異減小,復雜度和均勻度的粒徑差異增大,且粗粒徑細菌群落結構具有一定穩定性.

2.2 大氣細菌群落結構組成分析

對OTUs進行物種注釋分析,96.1%的OTUs被注釋到門分類水平,39.4%的OTUs被注釋到屬分類水平,另有4個OTUs未獲得注釋信息.在非霾天和霾天的所有粒徑樣品中均存在叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)和鞘氨醇單孢菌屬()兩個生物類群.叢毛單胞菌在環境中普遍存在[26],而鞘氨醇單孢菌屬也是環境常見菌屬[27].

分別在門和屬分類水平挑選豐度前10位的物種作微生物類群相對豐度圖(圖7).在門分類水平上(圖7a),霾天與非霾天均含有變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi),相對豐度見表3.其中變形菌門、厚壁菌門和放線菌門為青島冬季空氣細菌中的優勢菌群[13].門分類水平上霾天與非霾天的獨有物種見表4,非霾天獨有11個菌門,而霾發生時,獨有種類變為Verrucomicrobia、Spirochaetes、Tenericutes和Fibrobacteres門,大量種類細菌可能因環境變化而減少或消失.其中,輕度霾天獨有疣微菌門(Verrucomicrobia)和螺旋體門(Spirochaetes),重度霾天獨有纖維桿菌門(Fibrobacteres),均出現在粗粒子中.霾發生時,各粒徑樣品中變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度在66.4%~96.1%之間,明顯高于非霾天的情況.

表3 門分類水平共有物種在非霾天與霾天的相對豐度(%)

表4 門分類水平非霾天與霾天的獨有物種

表5 屬分類水平非霾天與霾天的獨有物種

在屬分類水平上,非霾天獨有物種53個(表5),相對豐度為7.7%,霾天獨有物種46個,相對豐度為5.0%,霾的發生改變了大氣細菌群落的組成.霾天與非霾天均發現棒狀桿菌屬()、擬桿菌屬()、鞘氨醇單胞菌屬()和假單胞菌屬()(圖6b),其中棒狀桿菌屬()是北京一次霧霾發生時的優勢微生物[4].擬桿菌屬()在北京霧霾、米蘭、紐約生物氣溶膠的研究中均有出現,是大氣中的優勢菌屬[4].假單胞菌屬()是青島市區街道冬季空氣細菌中的優勢菌屬[13],也是本次研究中非霾天的優勢菌屬.武麗婧[9]運用DGGE方法發現假單胞菌屬是青島霧、霾天氣發生后的優勢菌屬,與本研究霾發生后假單胞菌屬豐度降低不一致,可能是因為高通量測序方法較之DGGE方法檢測到的菌種更為豐富.霾發生時,各粒徑樣品中鞘氨醇單胞菌()相對豐度明顯升高,最高為重度霾天的0.65~1.1μm粒徑樣品,為92.1%,成為霾天的優勢菌屬,這與邵聰聰[21]采用克隆文庫方法的研究結果相一致.有研究發現,鞘氨醇單胞菌可以利用多種復雜有機物進行生長和代謝[28],鞘氨醇單胞菌具有特殊的代謝調控機制以適應環境條件的變化[27,29].霾天二次有機氣溶膠濃度的明顯升高[30-32],可能為它的生長提供了充足的營養源,導致鞘氨醇單孢菌屬在霾天占據優勢地位.

(a)門分類水平微生物類群相對豐度圖(b)屬分類水平微生物類群相對豐度圖

在屬分類水平與北京冬季大氣細菌群落結構特征[33]對比發現,非霾天北京大氣中的優勢菌屬為節桿菌()、肉食桿菌()和芽孢桿菌(),而青島則為假單胞菌、鞘氨醇單孢菌、韋榮球菌()和芽孢桿菌;霾發生時,北京大氣中的優勢菌屬為節桿菌和梭菌(),且梭菌的優勢度隨空氣質量的惡化逐漸增加,而青島大氣中的鞘氨醇單孢菌優勢度明顯.

2.3 大氣細菌群落結構相似性分析

從主成分分析中可以看出(圖8),非霾天與霾天空氣細菌群落結構差異較大,輕度霾天和重度霾天差異較小,說明霾發生時空氣細菌群落結構變化顯著.非霾天空氣細菌群落結構粒徑差異較大,而霾天粒徑差異較小,且隨著空氣質量的惡化,粒徑差異逐漸變小.本研究與武麗婧[9]分析的2013年青島霾天、霧天和晴天粗細粒徑大氣細菌群落結構的研究結果一致,即霾發生時,大氣細菌群落結構的粒徑差異低于非霾天.霾發生時,鞘氨醇單孢菌豐度的升高,以及細菌豐富度和多樣性的降低,導致細菌群落組成和結構較之非霾天更為簡單,可能是大氣細菌群落結構粒徑差異變小的主要原因.

從屬分類水平挑選豐度最高的前30個物種作物種豐度熱圖(圖9).非霾天時,優勢菌屬為假單胞菌屬()、韋榮氏球菌屬()和鞘氨醇單孢菌屬(),霾發生時,鞘氨醇單孢菌屬()含量明顯高于其它菌屬,是霾天的優勢菌屬.聚類結果顯示,18個樣品聚為兩大類,其中輕度霾天的0.65~1.1μm和2.1~3.3μm粒徑與非霾天的樣品聚為一類,其余霾天樣品聚為一類.說明在屬分類水平上,由非霾天到輕度霾天,0.65~ 1.1μm和2.1~3.3μm粒徑群落結構具有一定穩定性,輕度霾天與重度霾天細菌群落結構相似性較高.

利用Unifrac距離加權后對細菌群落整體結構進行聚類(圖10),18個樣品共聚為兩大類,其中非霾天樣品聚為一類,霾天樣品聚為一類,說明霾發生后,細菌群落結構發生明顯變化,且霾天細菌群落結構相似性較高.

2.4 健康風險分析

霾發生過程中,各種條件致病菌的增加或出現可能會給人類帶來健康風險.霾發生時,鞘氨醇單孢菌()的相對豐度明顯升高.空氣中的鞘氨醇單孢菌(如)能引起哺乳動物感染,引發各種炎癥、敗血癥等感染性疾病[27,29].霾天新檢出了皮生球菌屬、梭菌屬、纖毛菌屬、黃桿菌屬,它們均對人類健康存在潛在威脅.皮生球菌屬()最早從皮膚和水中分離[34],后在海洋沉積物中也有發現[35-37],其中可引起導管相關性血流感染[38].梭菌屬()(如)的增長可增加病毒復制和疾病風險[39].梭菌屬中的腐敗梭菌、魏氏梭菌、諾氏梭菌及溶組織梭菌等可引起豬惡性水腫病[40],產氣莢膜梭菌為條件致病菌,可引起眼部感染、氣性壞疽等疾病[41-42].纖毛菌屬()可能是男性尿道感染的病原體[43],還可能是新生兒感染的新興病原體[44],可引起化膿性關節炎[45].黃桿菌屬()中的細菌多數為條件致病菌[46],可引起術后感染、敗血癥、新生兒腦膜炎、獲得性呼吸道感染等疾病[47-49].

不同粒徑的粒子在呼吸道的沉積不同,粒徑小于10μm的大部分粒子會沉積在鼻腔內,可引發鼻竇炎等上呼吸道疾病,2.5μm以下的細顆粒物大部分沉積在支氣管,而1μm以下的細顆粒物則主要沉積在肺部[50].冬季是各種呼吸系統疾病的高發期[51].Cao等對北京冬季一次嚴重霾污染期間PM2.5和PM10中可吸入微生物的研究中發現,PM2.5和PM10中均存在肺炎鏈球菌()、煙曲霉()和人腺病毒屬C型(human adenovirus C)三種致病微生物[4].霾發生時,不同地區發現的致病微生物不同.濟南冬季重度霾天亞微米生物氣溶膠中鑒定出的細菌中有43.7%對人體、動物和植物健康有間接作用,包括、和[52].在西安秋季霾天期間,空氣中鑒定出了非霾天未檢測到的致病菌種奈瑟氏菌屬()、擬青霉屬()與頭孢霉屬()[53].不同粒徑上的微生物群落差異直接影響生物氣溶膠的健康效應,而以往的研究較少關注這一點.本次研究中,致病菌梭菌存在于2.1~3.3μm粒徑中,皮生球菌存在于3.3~4.7μm粒徑中,纖毛菌存在于大于4.7μm的粒徑中,黃桿菌和鞘氨醇單孢菌存在于所有粒徑中,根據不同致病菌在不同粒徑中的分布情況,更利于評估其對人體的健康風險.

3 結論

3.1 對青島冬季一次霾天與非霾天大氣細菌群落結構的16S rRNA基因高通量分析結果表明,霾發生時,空氣細菌群落結構和多樣性變化顯著.

3.2 非霾天與霾天空氣細菌群落結構差異較大,輕度霾天和重度霾天差異較小.由非霾到重度霾天過程中,大氣細菌群落豐富度和多樣性均降低,不同粒徑之間豐富度差異減小,復雜度和均勻度差異增大.

3.3 霾發生過程中,各種條件致病菌的增加或出現會給人體健康造成潛在風險,但霾天微生物對人體健康的風險評價還需要進一步深入研究.由于受各種條件的限制,我們只進行了一個采樣點同一時段的一次采樣,但本研究是利用高通量測序技術對青島霾天大氣細菌群落結構特征及其健康風險的初步探索,可以為今后的研究提供一定依據.

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致謝：感謝中國海洋大學環境科學與工程學院李鴻濤同學在樣品采集以及張玉師姐在數據處理過程中給予的幫助.

Bacterial community characteristics in different particle sizes of bioaerosols in winter haze days in Qingdao.

MA Man-man1,2,3, ZHEN Yu1,2,3*, MI Tie-zhu1,2,3, QI Jian-hua1,2,3, SHAO Cong-cong1,2, FENG Wen-rong1,2,3

(1.College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China；2.Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China；3.Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)., 2017,37(8)：2855~2865

Airborne bacterial community characteristics in winter haze days in Qingdao were studied using Illumina high-throughput sequencing. 807104 sequences obtained could be divided into 874 OTUs on 97% similarity level, and 344 OTUs were assigned to the genus level. The results showed that the bacterial community structure and diversity in bioaerosols varied significantly when the haze occurred. From non-haze day to severe haze day, both community richness and diversity of airborne bacteria decreased, and the difference of airborne bacterial community richness among particle sizes decreased gradually, while the difference of airborne bacterial community diversity among particle sizes increased gradually. The dominant bacteria in non-haze day were,and, while the dominant bacteria changed intoin haze days. During this haze event,, whose concentration increased, as well as new-detected,,andwere pathogens, may have health risks.

haze；16S rRNA；bacteria；community structure；health risks

X172

A

1000-6923(2017)08-2855-11

馬曼曼(1992-),女,山東東明人,中國海洋大學碩士研究生,主要研究方向為大氣微生物分子生態學.

2017-01-12

國家自然科學基金項目(41375143);教育部新世紀優秀人才支持計劃(NCET-13-0531)

* 責任作者, 副教授, zhenyu@ouc.edu.cn