稀土開采對土壤細菌群落組成與多樣性的影響

王友生,侯曉龍,蔡麗平,馬祥慶*

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稀土開采對土壤細菌群落組成與多樣性的影響

王友生1,2,侯曉龍1,蔡麗平1,馬祥慶1*

(1.福建農林大學林學院,福建福州 350002；2.福建省龍巖市林業科學研究所,福建龍巖 364000)

為探索稀土開采對土壤生態系統的影響,以長汀離子型稀土礦開采廢棄地為研究對象,通過采集稀土開采前、開采后的取土場和堆浸池的土壤,通過提取土壤DNA后,利用Illumina Miseq高通量測序平臺進行細菌的16S rDNA測序,分析以上3個作業區土壤細菌OTU組成,并以此為基礎進行物種注釋、多樣性和系統發育樹分析.研究結果表明:稀土開采后的取土場和堆浸池比開采前土壤細菌群落多樣性以及各類群組成豐度比例發生顯著變化,但土壤細菌的優勢種群不變,分別從門、綱、目、科、屬水平鑒定的優勢種為:厚壁菌(門)、芽孢桿菌(綱)、乳桿菌(目)、腸球菌(科)、腸球菌(屬),系統發育樹顯示厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、疣微菌門、酸桿菌門、硝化螺旋菌門、藍藻門、在系統發育上有一定的親緣關系.

稀土；土壤細菌；16S rDNA；群落；多樣性；系統發育樹

隨著全球經濟的快速發展,對礦產資源的消耗急劇上升[1].然而,礦山開采極易造成土壤擾動[2]、植被破壞、環境污染、生態惡化等[3-5]一系列問題,這已成為當今世界各國環境問題的重要組成部分[6-7].稀土作為全球重要的礦產資源,廣泛應用于軍事、工業等領域[8],需求量日趨增加[9].中國的稀土資源豐富,享有“稀土王國”稱號,特別是位于福建省長汀縣的稀土資源儲量很大.近年來隨著稀土價格的不斷攀升,長汀縣的稀土礦資源在短時間內被大量開采,由此造成土壤生態系統的破壞問題一直是人們關注的焦點.微生物是土壤生態系統的重要組成部分,在土壤生態系統中扮演重要角色,它們參與了土壤結構的形成[10],直接影響著土壤生態系統的穩定性和土壤肥力[11].細菌作為森林土壤微生物的最主要類群,其群落的變化可以先于土壤物理化學性質的變化做出響應,從而較早地揭示土壤生態環境的演變[12].已有研究表明礦區廢棄地特殊的環境分布著特有的細菌種類,且在復墾與植被恢復后土壤細菌群落多樣性及其組成也會隨之作出響應[13].另外,礦區土壤微生物的研究對礦區的生態恢復和微生物浸礦等領域具有一定的應用價值[14].因此,礦山廢棄地土壤細菌群落特征及其多樣性的研究成為環境科學界研究的熱點[15].

國內外在土壤細菌方面已開展了大量研究,其主要采用培養法,但培養法存在較多局限性,不能全面客觀地反映細菌的群落特征.近年來,隨著分子生物學的發展,16s rDNA測序技術在土壤細菌群落組成與多樣性研究上得到了廣泛應用[16-17],使得不可培養細菌的檢測成為可能,突破了傳統涂抹培養法對細菌種類分析的局限性[18].新技術的應用,使大量未知的微生物物種及其功能得到鑒定[19-20],土壤微生物群落結構多樣性獲得深入探明[21-22],各物種間的系統發育關系得到進一步揭示[23-24],植物-微生物-土壤之間相互作用機制的研究正不斷推進[25].

但目前國內外關于采礦作業對土壤細菌群落生態方面的影響研究甚少,特別在離子型稀土礦區土壤細菌方面的研究更少.堆浸生產是目前長汀離子型稀土礦開采的主要方法之一,是從取土場挖取土壤運送到堆浸池后,用酸性硫酸銨淋洗,再用清水淋洗提取稀土,最后被遺棄的土壤,形成廢棄堆浸池[26].因此稀土開采廢棄地主要由取土場與堆浸池構成.鑒于此,本文以長汀紅壤區離子型稀土礦采礦前以及開采后形成的取土場和堆浸池為研究對象,在分析土壤理化性質基礎上,通過第三代misequ高通量測序平臺對不同采樣區土壤細菌進行16s rDNA測序,分析開采前后不同作業區土壤細菌在各分類水平上的種群多樣性及其差異,揭示稀土開采對土壤細菌群落影響的內在機制,為稀土礦廢棄地的生態恢復和土壤微生物生態學研究提供科學依據.

1 試驗地概況

表1 稀土開采前后的土壤物理性質

注:小寫字母表示0.05水平LSD多重比較結果,下同.

表2 稀土開采前后的土壤化學性質

試驗地位于福建省長汀縣河田鎮(25°42′N, 116°86′E),海拔316m年平均氣溫17.5~18.8℃,極端最高氣溫38.9℃,極端最低氣溫-4.9℃,年平均降水量1737.1mm,年日照時數1924.6h,無霜期平均260d,土壤為粗晶花崗巖發育的砂壤土,極易造成水土流失.稀土開采前后土壤的理化性質見表1和表2[27].

長汀縣采用堆浸工藝生產稀土,形成的稀土開采廢棄地有兩種類型:取土場與廢棄堆浸地.取土場是表層土壤被挖取后剩余的裸地.廢棄堆浸地是從取土場挖取含稀土土壤運送到簡易堆浸池后,用2%硫酸銨反復淋洗,再用清水反復淋洗提取稀土,最后被遺棄的土壤,廢棄堆浸池面積500m2.

2 材料與方法

2.1 土壤取樣

2015年8月,在長汀稀土廢棄地的簡易堆積池、取土場及其周邊未開采地上采樣(圖1).分別布設10個10m×10m樣方,在每個樣方內按梅花型布點,用經過高溫滅菌的組培瓶采集0~20cm的土樣5個,共取土壤樣品150個.同一采樣區的土樣在超凈工作臺上挑出砂礫與植物根系并混合均勻,取300g用干冰保存,用于土壤細菌16S rDNA測序.

2.2 土壤DNA提取與16S rDNA擴增

采用Fast DNAaSPN Kit for Soil試劑盒(Bio 101,Vista,CA,USA)和Fast Prep FP220核酸提取儀提取,用熒光計測定提取液中雙鏈DNA濃度,用瓊脂凝膠電泳(瓊脂凝膠濃度:1%,電壓:150V,電泳時間:40min)測定DNA完整性.然后以此DNA為模板,對16S rDNA V4可變區進行PCR擴增,擴增引物為515F-806R,PCR預混液采用NEB Phusion High-Fidelity PCR Master

Mix.PCR反應體系如下:30ng DNA、4μL引物、25μL PCR預混液,用超純水補充至50μl.PCR反應條件如下:98℃預變性3min,98℃變性45s, 55℃退火45s,72℃延伸45s,30個循環后72℃延伸7min,最后保持在4℃環境下.

3 結果與討論

3.1 稀土開采對土壤細菌多樣性的影響

從土壤細菌多樣性指數(表3)可看出,3個作業區樣品的測序深度指數Coverage(Good’s nonparametric coverage estimator)均在0.8左右,表明測序結果可以反映樣品的實際情況.采礦后堆浸池與取土場土壤的observed species指數(Sobs)、chao1指數(chao1-based coverage estimator)、ACE指數(abundance-based coverage estimator)均顯著大于采礦前對照,說明稀土開采后土壤細菌豐度顯著提高.shannon指數(nonparametric Shannon diversity index)顯著大于采礦前對照,而simpson指數(nonparametric Shannon diversity index)則顯著小于采礦前對照(<0.05),說明稀土開采后土壤細菌群落的多樣性顯著提高.

土壤細菌群落組成與多樣性受土壤重金屬含量、理化性質、地下食物鏈、地表植物組成、人為干擾等因素的影響[28],長汀稀土礦開采后土壤細菌多樣性指數上升,其原因一方面是由于長汀稀土主要分布在強度水土流失區,由于長期來的植被破壞,植被稀少且蓋度低,對土壤微生物的影響有限;另一方面可能是由于長汀稀土采礦前土壤稀土含量較高[29],土壤微生物受到抑制,而采礦后形成的取土場與堆浸池稀土含量較少,低濃度的稀土對土壤細菌的代謝有刺激作用[30-31].從取土場與堆浸之間的多樣性指數比較可看出,取土場土壤細菌多樣性高于堆浸池,一方面可能是堆浸池里殘留的酸性提取液對土壤pH值的影響,在酸性環境下重金屬得到活化,不利于土壤細菌的生存,從而降低土壤細菌的種類與數量,另外高濃度浸提劑(硫酸銨)對土壤微生物也存在抑制效應[30];另一方面可能是長汀稀土礦屬風化殼離子型,礦體主要分布在土層10m以上[32],取土場多為10m以下的下層土,稀土含量較低,且經多年荒廢后表層土壤水熱條件得到改善,促進土壤細菌的繁衍與生存.

3.2 稀土開采對土壤細菌群落組成的影響

在97%相似度情況下,OTU與NCBI Greengene數據庫比對結果發現,樣品可以在門、綱、目、科、屬這五個分類水平上進行物種注釋,分類結果顯示3個作業區在門、綱、目、科、屬水平上的主要群落組成相同,即采礦前、取土場、堆浸池在門水平上厚壁菌門分別占98.64%, 95.57%,71.57%;在綱水平上芽孢桿菌綱分別占98.34%,95.11%,71.38%;在目水平上乳桿菌目分別占90.32%.85.00%.64.80%;在科水平上腸球菌科分別占89.20%,82.93%,64.12%;在屬水平上腸球菌屬分別占89.20%,82.93%,64.12%.

金屬礦區常發現有特定的細菌類群[14],稀土礦開采前的土壤中發現有1個特有的門(梭菌門);在門分類水平上堆浸池有2個特有的類群,分別為綠菌門、WS3;取土場有5個特有的門,分別是GAL15,GN02,OP3,TM7,Thermi.取土場的細菌種類較豐富,有1個特有的綱(Synechococcophycideae),2個特有的目(纖細桿菌目、Pseudanabaenales),1個特有的科(纖細桿菌科).在3個作業區土壤中均鑒定出相對豐度>0.5%的2株細菌,一株為類芽孢桿菌,另一株為蠟樣芽孢桿菌.這些細菌在稀土礦區土壤修復及稀土浸提領域中可能存在一定的應用價值.

從屬分類水平上的絕對豐度發現各種細菌數量均表現為:QTC>DJC>BM,其中>104個的細菌僅為腸球菌屬,其在稀土開采后呈下降趨勢. 芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬的數量介于103~104之間,二者在稀土開采后呈上升趨勢.中量(102~103)細菌中除、在取土場中下降,藤黃單胞菌屬、伯克氏菌屬、、甲基桿菌屬、紅游動菌屬、慢生根瘤菌屬、出芽菌屬、嗜堿菌屬、、、在稀土開采后的兩類廢棄地中呈不同程度上升.微量(10~102)與痕量(<10)細菌在3個采樣區的細菌物種豐度皆最大,分別分布37、59屬.

土壤養分對土壤細菌的棲息具強烈影響,養分貧瘠的土壤中酸桿菌門分支的細菌具有更強的競爭能力,長汀稀土開采后取土場、堆浸池土壤有機質顯著下降,土壤酸桿菌呈不同程度的增加,這與Smit等[33]的結論相一致.

一般而言,酸桿菌與變形菌是森林土壤細菌的優勢菌群,長汀稀土開采對土壤細菌種群的分布產生了顯著影響,從門分類水平上看,稀土礦區各作業區的土壤優勢菌群均為厚壁菌,一方面可能與稀土礦區土壤含有稀土及鎘、鉛等重金屬有關[26];另一方面,可能與稀土開采前后土壤理化發生了顯著變化,但養分仍處于貧瘠水平,結構仍然是以砂礫含量較高的砂壤土有關;當然,也可能與土壤細菌各種群間存在共生或拮抗關系[14],使得種群處于特定的平衡狀態有關.王建宏[34]在外源稀土積累的尾礦壩研究中也發現類似的結論.

表3 稀土開采前后土壤細菌α多樣性

3.3 群落相似性分析

從群落相似性Jacacard指數(表4)可看出,取土場與采礦前、堆浸池與采礦前、取土場與堆浸池的土壤細菌群落相似性指數均小于0.3,均處極不相似水平,說明稀土開采對土壤細菌種群結構產生了極顯著的影響,且開采后形成的兩類廢棄地土壤細菌群落存在極顯著差異.

表4 各群落間Jaccard指數

3.4 稀土礦區土壤微生物種群進化分析

為了進一步了解稀土礦區土壤細菌物種間的進化關系,選擇一條豐度最高的序列分析其在屬水平上構建物種系統進化樹.這條序列中包含115個屬,分別對應于12個門,具體如下:

1)變形菌門由55屬組成,其中-變形菌亞門由20屬組成,分別為:中慢生根瘤菌屬、、土微菌屬、生絲微菌屬、蒼白桿菌屬、、甲基桿菌屬、苯甲基桿菌屬、短波單胞菌屬、柄桿菌屬、紅游動菌屬、慢生根瘤菌屬、黃色桿菌屬、拜葉林克氏菌屬、、赤桿菌屬、新鞘脂菌屬、、、鞘脂單胞菌屬、副球菌屬、、、紅桿菌屬、氨基桿菌屬、葡糖桿菌屬、玫瑰球菌屬;γ-變形菌亞門由25屬組成,分別為:立克次氏小體屬、、蛭弧菌屬、厭氧粘細菌屬、單胞菌屬、、熱單胞菌屬、寡養單胞菌菌、溶桿菌屬、獨島菌屬、纖維弧菌屬、希萬氏菌屬、沙雷氏菌屬、弧菌屬、鹽弧菌屬、不動桿菌屬、水棲菌屬、嗜血菌屬、、硫桿狀菌屬、伯克氏菌屬、、假單胞菌屬、、.

2)厚壁菌門由18屬組成,分別為:嗜堿菌屬、、、、梭菌屬、顫螺旋菌屬、P-75-a5、鏈球菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、

、肉食桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、短芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬.

3)放線菌門由14屬組成,分別為:、節細菌屬、、纖維菌屬、、壤霉菌屬、假諾卡氏菌屬、擬無枝酸菌屬、棒狀桿菌屬、分支桿菌屬、類諾卡氏菌屬、馬杜拉放線菌屬、.

4)擬桿菌門由12屬組成,分別為:、鞘脂桿菌屬、、螺狀菌屬、、黃桿菌屬、金黃桿菌屬、普氏菌屬、、擬桿菌屬、.

5)疣微菌門由5 屬組成,分別為:Ellin506、DA101、Chthoniobacter、Candidatus Xiphinematobacter、豐祐菌屬.

)浮霉菌門由4屬組成,分別為:出芽菌屬、小梨形菌屬、、浮霉狀菌屬.

7)酸桿菌門由3屬組成,分別為:Candidatus Koribacter、Terriglobus、Candidatus Solibacter.

8)硝化螺旋菌門由2屬組成,分別為:硝化螺旋菌屬、JG37-AG-70.

9)衣原體門僅由Candidatus Protochla組成.

10)異常球菌-棲熱菌門僅由異常球菌屬組成.

11)藍藻門僅由瘦鞘絲藻屬組成.

12)梭菌門僅由纖毛菌屬組成.

3.5 優勢細菌與土壤環境的冗余分析

從圖2可看出,厚壁菌與總氮的相關性最大,但也與有效磷、全鉀、有機質、全磷、pH值存在正相關,與水解性氮、有效鉀、容重、>0.25mm水穩定團聚體呈負相關;變形菌則與>0.25mm水穩定團聚體相關性最大,同時也受pH值、容重、全磷、有效鉀的影響,水解性氮、有機質、全鉀、有效磷、全氮對變形菌活性有一定的抑制作用.

長汀稀土開采后的兩類廢棄地土壤最大持水量、最小持水量、毛管持水量、非毛管孔隙、毛管孔隙均顯著下降,土壤細菌多樣性皆增加,這可能是由于土壤水分物理性質改變,加大了土壤的異質性,從而增加土壤微生物多樣性,這與Zhou等[35]的研究結論相一致.

已有研究表明土壤團粒結構與土壤細菌的分布呈密切相關,長汀稀土開采后取土場土壤的團粒結構發生顯著變化,主要表現為大顆粒(>5mm)的比例顯著增加,堆浸池則未發現顯著變化.從門分類水平上看,堆浸池土壤變形菌相對豐度增加,可見變形菌在大顆粒的砂質土壤中具較大豐度,這與陳香碧等[28]的研究結論相一致.

有研究表明土壤pH值對土壤細菌的豐度呈正相關,稀土礦區開采前后pH值發生顯著變化,土壤優勢細菌的豐度也發現類似規律.

ρb、AS、TN、TK、TP、AN、AP、AK、OM、pH分別代表容重、>0.25mm水穩定團聚體、全氮、全鉀、全磷、堿解性氮、有效磷、有效鉀、有機質、酸堿度

RDA分析結果表明變形菌門主要受土壤有機質、全氮、有效磷、速效鉀的影響,這與黎寧等[36]的結論一致.在屬分類水平上看,長汀稀土礦開采前后的土壤中均含有6個屬的細菌,但李兆龍在廣東和平縣的稀土礦研究中發現采礦前有兩個屬的細菌,但采礦后僅發現有一個屬的細菌.這與本研究結果差異較大,其原因一方面可能與研究區域土壤理化性質及氣候差異有關[37],另一方面可能與不同礦區稀土含量的差異,從而影響土壤細菌類群的生存有關[38].

4 結論

4.1 長汀離子型稀土礦開采后,形成的取土場與堆浸池廢棄地土壤理化性質發生顯著變化導致土壤細菌群落結構發生顯著變化,其豐度與多樣性均比對照地顯著提高.

4.2 稀土開采后土壤細菌優勢物種未發生顯著變化,從門、綱、目、科、屬分別鑒定為厚壁菌(門)、芽孢桿菌(綱)、乳桿菌(目)、腸球菌(科)、腸球菌(屬).

4.3 稀土礦3個作業區土壤中均鑒定出相對豐度>0.5%的2株細菌,一株為類芽孢桿菌,另一株為蠟樣芽孢桿菌.

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致謝：本試驗的外業采樣工作得到福建省長汀縣水土保持站彭紹云等同志的大力協助,在此表示衷心的感謝.

Impacts of rare earth mining on soil bacterial community composition and biodiversity.

WANG You-sheng1,2, HOU Xiao-long1, CAI Li-ping1, MA Xiang-qing1*

(1.Forest College of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China；2.Longyan Forestry Science Institute of Fujian Province, Longyan 364000)., 2017,37(8)：3089~3095

Experiment was designed examine impacts of rare earth mining on soil ecosystem health in Changting. Soil samples were taken from depths of 0~20cm in pre- and post-mined areas (rented earth pits, heap-leaching mine area). Microbial DNA was extracted from soil samples and then 16S rDNA gene sequencing was carried out using Illumina MiSeq equipment. Examination of bacteria species present showed the microbial population was dominated by the level of phylum, class, order, families and genus and these were Firmicutes, Bacilli, Lactobacillales, Enterococcaceae,. The phylogenetic tree showed there were certain genetic relationships among Firmicutes, Proteobacteria, Actinobactera, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Acidobacteria, Nitrospirae, Cyanobacteria, Thermi. Alpha diversity index was calculated based on operational taxonomic units (OTUs). Results indicated that soil bacterial diversity and taxonomic composition distribution changed significantly in post-mining areas compared to control areas. However, the predominant bacteria in the soil communities did not change.

rare earth；soil bacteria；16S rDNA；community；diversity；phylogenetic tree

X17

A

1000-6923(2017)08-3089-07

王友生(1981-),男,福建永泰人,福建農林大學博士研究生,主要從事退化生態系統恢復與重建研究.

2017-03-21

國家科技支撐計劃項目(2014BAD15B02)國家公益性行業科研專項(201111020–2);福建省產學合作科技重大項目(2013N5002);國家林業局林業公益性行業科研項目(201304303);

* 責任作者, 教授, lxymxq@126.com