TAZ與胰腺癌細胞增殖和抗凋亡能力的關系研究

占 婷，羅和生，田 霞，黃曉東

1.武漢大學附屬同仁醫(yī)院(武漢市第三醫(yī)院)消化內科，湖北 武漢430060； 2.武漢大學人民醫(yī)院消化內科

TAZ與胰腺癌細胞增殖和抗凋亡能力的關系研究

占 婷1,2，羅和生2，田 霞1，黃曉東1

1.武漢大學附屬同仁醫(yī)院(武漢市第三醫(yī)院)消化內科，湖北 武漢430060； 2.武漢大學人民醫(yī)院消化內科

目的 探討轉錄共激活因子TAZ對胰腺癌細胞增殖與抗凋亡能力的影響及其作用機制，為胰腺癌尋找新的診斷與治療靶點提供思路。方法 用空載病毒(對照組)、TAZ過表達病毒(Lv-TAZ)和TAZ干擾病毒(siTAZ)轉染胰腺癌細胞后用CCK8法檢測各組細胞的增殖情況；流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率；Western blotting檢測各組細胞的PTEN、Akt、p-Akt的表達情況。結果 與對照組相比，Lv-TAZ組細胞增殖率升高，siTAZ組細胞增殖率下降。與對照組相比，Lv-TAZ組細胞凋亡率下降，siTAZ組細胞凋亡率升高。Western blotting結果顯示，Lv-TAZ組細胞PTEN表達水平下調，p-Akt上調；siTAZ組細胞PTEN表達水平上調，p-Akt下調。結論 TAZ在胰腺癌細胞中可能通過調控PTEN/Akt信號通路發(fā)揮其促增殖和抗凋亡作用。

胰腺癌；TAZ；PTEN/Akt信號通路

近年來胰腺癌的發(fā)病率和死亡率不斷升高，使其成為消化系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤之一[1]。目前，手術切除是胰腺癌唯一根治的方法，但是由于侵襲性強，大部分胰腺癌患者就診時已經(jīng)發(fā)生局部或遠處轉移，失去根治性手術的機會[2]。因此，我們迫切需要對胰腺癌發(fā)病機制進行深入研究，以尋找新的治療策略。

轉錄共激活因子TAZ (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) 于2000年作為14-3-3蛋白的結合蛋白而被發(fā)現(xiàn)，參與哺乳動物多種組織的生長[3]。作為一種轉錄共激活因子，TAZ通過與多種轉錄因子如TEA結構域家族轉錄因子、Runt功能域轉錄因子等結合而發(fā)揮不同的作用[4-5]。越來越多研究已經(jīng)證實，TAZ參與腫瘤形成、細胞增殖與遷移、上皮細胞間質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)等一系列過程[6-8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，TAZ在胰腺癌組織和細胞中高表達，且能夠促進胰腺癌細胞的遷移、侵襲、EMT。然而TAZ對胰腺癌細胞增殖與抗凋亡能力的影響仍未見報道。因此，本研究著重討論TAZ對胰腺癌細胞的增殖與凋亡能力的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系及細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞PANC1購自中國科學院上海細胞庫。細胞在37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)基為含1%雙抗(Thermo Fisher Scientific,美國)、100 g/L胎牛血清(NQBB, USA)的高糖培養(yǎng)基DMEM (Gibco, Carlsbad,美國)。

1.2 細胞轉染 TAZ的靶向siRNA慢病毒(siTAZ)以及過表達病毒(Lv-TAZ)由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。將細胞接種于6孔板，于第2天按照操作說明書加入適量慢病毒、Ploybrene和Enhance培養(yǎng)12 h后換成完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 Western blotting檢測 轉染后的細胞用RIPA裂解液(北京普利萊基因技術有限公司)裂解提蛋白后，用BCA蛋白濃度測定盒(碧云天生物技術研究所)測蛋白濃度。將蛋白與loading buffer混合后100 ℃變性10 min,再用100 g/L SDS-PAGE膠分離蛋白，然后轉到NC膜上,隨后用兔抗人TAZ(CST,美國)、PTEN(CST,美國)、Akt(CST,美國)、p-Akt(CST,美國)、GAPDH(Santa Cruz,美國)多克隆抗體于4 ℃中孵育過夜。最后用羊抗兔二抗(Lincoln，美國)在室溫下孵育1 h，蛋白表達水平用ECL化學發(fā)光顯色試劑盒檢測。

1.4 CCK-8檢測 將轉染后的細胞接種于96孔板中，然后用CCK8試劑(日本同仁化學研究所)分別檢測各種細胞在24 h、48 h、72 h、96 h時450 nm的OD值以反映細胞的增殖情況。

1.5 流式細胞檢測 將轉染后的細胞于6孔中培養(yǎng)3 d后，根據(jù)Annexin V-PE凋亡試劑盒(BD Bioscience,美國)的說明書處理細胞后用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，說明數(shù)據(jù)的圖用GraphPad Prism 5制作，采用t檢驗和單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TAZ對胰腺癌細胞增殖與抗凋亡能力的影響 首先用空載對照病毒(對照組)、TAZ干擾病毒(siTAZ組)和過表達病毒(Lv-TAZ 組)轉染胰腺癌細胞PANC1，轉染效率見圖1。CCK-8檢測結果顯示，與對照組比較，Lv-TAZ 組細胞增殖率升高，siTAZ 組細胞增殖率下降(見圖2)。將轉染后的胰腺癌細胞用流式細胞儀檢測其凋亡情況，結果顯示，與對照組相比，Lv-TAZ 組細胞凋亡率下降，siTAZ 組細胞凋亡率升高(見圖3)。

圖1 轉染病毒后各組細胞TAZ蛋白的表達情況；圖2 轉染病毒后各組細胞的增殖情況

Fig 1 The expression of TAZ protein after transfection of the virus in each group; Fig 2 The proliferation of cells after transfection of the virus in each group

2.2 TAZ在胰腺癌細胞中對PTEN/Akt信號通路的作用 將PANC1細胞用空載病毒、TAZ干擾病毒和過表達病毒轉染后提取蛋白，然后用Western blotting檢測PTEN、Akt、p-Akt蛋白的表達情況。結果顯示，與對照組相比，Lv-TAZ組蛋白PTEN表達下調，siTAZ組蛋白PTEN表達上調(見圖4)。而與對照組相比，Lv-TAZ組蛋白p-Akt表達上調，siTAZ組蛋白p-Akt表達下調，而Akt表達量無明顯改變(見圖5)。

3 討論

近幾年來雖然胰腺癌的手術治療已經(jīng)有了很大的提升，但大多數(shù)患者在確診的時候已經(jīng)在中晚期，失去了切除機會[10]，因此，我們迫切需要研究早期胰腺癌的檢測和治療靶點。最近研究[11-12]顯示，胰腺癌本質上是一種由于基因和表觀遺傳學的改變而導致的基因性疾病。因此，研究能夠促進胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的關鍵基因能夠為胰腺癌早期檢測及治療提供新的思路。

TAZ是一種含有WW結構域的轉錄共激活因子，是Hippo信號通路重要的下游效應因子。該信號通路在器官大小、干細胞功能維持、腫瘤發(fā)生調節(jié)上都發(fā)揮著重要作用[13]。當Hippo信號通路激活時，該通路中的絲/蘇氨酸蛋白激酶MST1/2作用于腫瘤抑制基因LATS1/2激酶使其磷酸化，導致其下游的效應因子TAZ失活[14]。近年來，TAZ被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中表達升高，如肝癌[15]、胃癌[16]、乳腺癌[17]等，提示TAZ在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

研究[9]發(fā)現(xiàn)，TAZ在胰腺癌組織和細胞中高表達，并能夠促進胰腺癌細胞的遷移、侵襲、EMT。

圖3 轉染病毒后各組細胞的凋亡情況Fig 3 Apoptosis after transfection of the virus in each group

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.001。

圖4 轉染病毒后各組細胞PTEN蛋白的表達情況

Fig 4 The expression of PTEN protein after transfection of the virus in each group

注：與對照組比較，*P<0.05。

圖5 轉染病毒后各組細胞p-Akt及Akt蛋白的表達情況

Fig 5 The expressions of p-Akt protein and Akt protein after transfection of the virus in each group

然而TAZ對胰腺癌細胞增殖與抗凋亡能力的影響及作用的可能機制仍未見報道。而在我們的實驗中，通過過表達TAZ的表達和干擾TAZ的表達，發(fā)現(xiàn)TAZ的表達水平與胰腺癌細胞的增殖率呈正相關，與胰腺癌細胞的凋亡率呈負相關。這些結果證實了TAZ能夠增強胰腺癌的增殖與抗凋亡能力。PTEN 是公認的腫瘤抑制因子，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[18]，而我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，TAZ的表達水平與PTEN蛋白的表達水平呈負相關。PTEN是PI3K-Akt通路上的一個重要的抑制因子，它可以使PIP3去磷酸化成為PIP2從而抑制 Akt的磷酸化使其失活[19]。P13K/Akt信號通路過度激活常見于多種腫瘤，與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[20]?；罨腁kt是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的一個重要因素,它能夠使PIP2促進細胞增殖，減少細胞凋亡，降低細胞對藥物的敏感性[21-22]。 為了探討TAZ與活化的Akt之間的潛在關系，我們檢測p-Akt與Akt在轉染后的胰腺癌細胞中的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)在TAZ過表達的胰腺癌細胞中p-Akt表達升高，在干擾了TAZ表達的胰腺癌細胞中，p-Akt表達下降，而與Akt表達水平基本一致。這些結果提示，TAZ在胰腺癌細胞中可能通過調控PTEN的表達進而激活Akt信號通路。

總之，我們的研究表明，TAZ在胰腺癌細胞中可能通過調控PTEN/Akt信號通路來發(fā)揮其促增殖和抗凋亡作用。因此，我們可以認為TAZ是胰腺癌早期診斷和治療的潛在靶點。

[1]Chen W, Zheng R, Zhang S, et al. Report of cancer incidence and mortality in China, 2010 [J]. Ann Transl Med, 2014, 2(7): 61.

[2]Von Hoff DD, Ervin T, Arena FP, et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine [J]. N Engl J Med, 2013, 369(18): 1691-1703.

[3]Kanai F, Marignani PA, Sarbassova D, et al. TAZ: a novel transcriptional co-activator regulated by interactions with 14-3-3 and PDZ domain proteins [J]. EMBO J, 2000, 19(24): 6778-6791.

[4]Cui CB, Cooper LF, Yang X, et al. Transcriptional coactivation of bone-specific transcription factor Cbfa1 by TAZ [J]. Mol Cell Biol, 2003, 23(3): 1004-1013.

[5]Mahoney WM Jr, Hong JH, Yaffe MB, et al. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members [J]. Biochem J, 2005, 388(Pt 1): 217-225.

[6]Xiang L, Gilkes DM, Hu H, et al. Hypoxia-inducible factor 1 mediates TAZ expression and nuclear localization to induce the breast cancer stem cell phenotype [J]. Oncotarget, 2014, 5(24): 12509-12527.

[7]Bartucci M, Dattilo R, Moriconi C, et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells [J]. Oncogene, 2015, 34(6): 681-690.

[8]Huang W, Lv X, Liu C, et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition [J]. J Biol Chem, 2012, 287(31): 26245-26253.

[9]Xie D, Cui J, Xia T, et al. Hippo transducer TAZ promotes epithelial mesenchymal transition and supports pancreatic cancer progression [J]. Oncotarget, 2015, 6(34): 35949-35963.

[10]Xie D, Xie K. Pancreatic cancer stromal biology and therapy [J]. Genes Dis, 2015, 2(2): 133-143.

[11]Campbell PJ, Yachida S, Mudie LJ, et al. The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer [J]. Nature, 2010, 467(7319): 1109-1113.

[12]Yachida S, Jones S, Bozic I, et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer [J]. Nature, 2010, 467(7319): 1114-1117.

[13]Pan D. The hippo signaling pathway in development and cancer [J]. Dev Cell, 2010, 19(4): 491-505.

[14]Harvey KF, Zhang X, Thomas DM. The Hippo pathway and human cancer [J]. Nat Rev Cancer, 2013, 13(4): 246-257.

[15]Xiao H, Jiang N, Zhou B, et al. TAZ regulates cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition of human hepatocellular carcinoma [J]. Cancer Sci, 2015, 106(2): 151-159.

[16]Zhou GX, Li XY, Zhang Q, et al. Effects of the hippo signaling pathway in human gastric cancer [J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14(9): 5199-5205.

[17]Rashidian J, Le Scolan E, Ji X, et al. Ski regulates Hippo and TAZ signaling to suppress breast cancer progression [J]. Sci Signal, 2015, 8(363): ra14.

[18]McCabe N, Kennedy RD, Prise KM. The role of PTEN as a cancer biomarker [J]. Oncoscience, 2016, 3(2): 54-55.

[19]Carnero A, Paramio JM. The PTEN/PI3K/AKT Pathway in vivo, cancer mouse models [J]. Front Oncol, 2014, 4: 252.

[20]Bartholomeusz C, Gonzalez-Angulo AM. Targeting the PI3K signaling pathway in cancer therapy [J]. Expert Opin Ther Targets, 2012, 16(1): 121-130.

[21]Hers I, Vincent EE, Tavaré JM. Akt signalling in health and disease [J]. Cell Signal, 2011, 23(10): 1515-1527.

[22]Steelman LS, Chappell WH, Abrams SL, et al. Roles of the Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR pathways in controlling growth and sensitivity to therapy-implications for cancer and aging [J]. Aging (Albany NY), 2011, 3(3): 192-222.

(責任編輯：李 健)

Relationship of TAZ with proliferation and anti apoptotic ability of pancreatic cancer

ZHAN Ting1,2, LUO Hesheng2, TIAN Xia1, HUANG Xiaodong1

1.Department of Gastroenterology, Wuhan Third Hospital, Tongren Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060; 2.Department of Gastroenterology, People’s Hospital of Wuhan University, China

Objective To investigate the effect and functionary mechanism of TAZ on the proliferation and anti apoptotic ability of pancreatic cancer cells, and to provide a new way for the diagnosis and treatment of pancreatic cancer.Methods Pancreatic cancer cells were transfected with lentiviral vector expressing TAZ (Lv-TAZ) and TAZ siRNA lentiviral vector (siTAZ), and then CCK8 was used to detect the proliferation. Flow cytometry was used to detect the apoptosis. Western blotting was used to detect the expressions of PTEN, Akt, p-Akt.Results Compared with the control group, the proliferation rate of cells transfected with Lv-TAZ was increased, and the cell proliferation rate of cells transfected with siTAZ was decreased. Compared with control group, the apoptosis rate of cells transfected with Lv-TAZ was decreased, and the apoptosis rate of cells transfected with siTAZ was increased. Western blotting results showed that the expression of PTEN in cells transfected with Lv-TAZ was downregulated, and the expression of p-Akt was upregulated. On the contrary, the expression of PTEN in cells transfected with siTAZ was upregulated, and the expression of p-Akt was downregulated.Conclusion TAZ may play a role in promoting the proliferation and anti apoptosis by regulating PTEN/Akt signaling pathway in pancreatic cancer cells.

Pancreatic cancer; TAZ; PTEN/Akt signaling pathway

湖北省科技支撐計劃項目(2015BHE022)

占婷,在讀碩士研究生，研究方向：胰腺癌。E-mail：472308046@qq.com

黃曉東，博士，主任醫(yī)師，研究方向：消化道動力障礙性疾病。 E-mail：13886190549@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.07.006

R735.9

A

1006-5709(2017)07-0741-03

2016-12-17