M細胞及AIEC經M細胞途徑致克羅恩病研究進展

楊厚淶，孫華文，孫科明，王秋爽

武漢大學人民醫院胃腸外科，湖北 武漢 430060

M細胞及AIEC經M細胞途徑致克羅恩病研究進展

楊厚淶，孫華文，孫科明，王秋爽

武漢大學人民醫院胃腸外科，湖北 武漢 430060

M細胞具有特殊的形態結構，其作為腸道一種免疫細胞，也是一種特殊的抗原轉運細胞，與腸黏膜免疫功能密切相關。在克羅恩病(Crohn’s disease,CD)早期，存在M細胞增生、破裂這種細胞學水平的病理損傷，本研究就目前國內外學者所做M細胞的起源、形態結構、功能及貼壁侵入性大腸桿菌(adherent-invasive Escherchia coli,AIEC)經M細胞途徑致CD研究進展作一概述。

M細胞；起源；形態結構；功能；克羅恩病；侵入性大腸桿菌

消化道黏膜是人體最大的免疫器官。消化道黏膜表面經常受到外來抗原物質侵襲，如病毒、細菌及顆粒物質和寄生蟲等。胃腸道抗原物質的行為很大程度上由它們與胃腸道的各種障礙相互作用決定。這些障礙包括胃液pH環境、胃腸道酶降解、黏液屏障和腸上皮屏障。在胃中，酸性環境中能誘導腸內容物氧化或水解。胃腸酶，如蛋白酶、核酸酶和脂肪酶，導致生物分子的降解和消化。因此，腸上皮是調節進入腸腔的物質侵入全身和淋巴循環的物理和生理屏障。腸道黏膜內存在豐富的孤立淋巴小結、彌散淋巴組織及集合淋巴小結，這些共稱為腸道相關淋巴組織(GAIT)。腸上皮的保護作用主要由于免疫感應組織的存在，即Peyer氏斑(PP)，可以觸發抗原刺激后的免疫反應[1]。這種上皮的特征在于存在微褶皺細胞(Microfold cell，M細胞)，其表面沒有致密的微絨毛，取而代之的是豐富的小微褶皺，也有人稱之為膜性細胞(membranous cell)。腸道M細胞主要存在于PP上的濾泡相關上皮細胞(follicle-associated epithelium，FAE)、孤立淋巴結、闌尾和胃腸道外的黏膜相關淋巴組織；也是除小腸上皮細胞外，參與腸道免疫的細胞，是一種特殊的抗原運轉細胞(包括轉運蛋白質、病毒、細菌、顆粒物質和寄生蟲等)[2-3]。

1 M細胞的分化起源

目前認為，M細胞起源于小腸微絨毛和派氏結圓頂之間隱窩內的干細胞，該類干細胞具有不確定的分化方向，有兩種完全不同的分化、遷移軸，可向微絨毛方向遷移，此類細胞分化成為吸收性腸上皮細胞、腸內分泌細胞和杯狀細胞，也可向派氏結圓頂遷移，此類細胞則分化成為FAE細胞和M細胞[4]。目前為止，在體內研究M細胞的功能仍然很困難，由于低M細胞數和對M細胞分化程序缺乏了解，導致缺乏一些實驗工具來操縱M細胞在體內的功能[5]。體外研究已經表明，PP的衍生細胞可以在人結腸癌Caco-2細胞誘導出M細胞的特性。功能性M細胞在B細胞缺陷[6]、CD137缺陷[7]和趨化因子CC受體6(CC R6)缺陷的小鼠中均不存在。在CCR6缺陷小鼠，該表型可以通過CCR6+CD11cintB細胞[8]的植入被還原正常，這表明B細胞可以誘導M細胞的表型。最近這個概念被改進，以區別在M細胞發展的兩個獨立的步驟：(1)M細胞譜系B細胞非依賴性分化;(2)B細胞依賴性分化，其導致功能活性轉運M細胞的形成[7]。M細胞的分化程序可以被NF-κB配體(RANKL)的受體活化劑的應用誘導，這種活化劑是非造血間充質細胞表達的腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員[9]。通過RANKL途徑誘導產生的M細胞已經具備功能M細胞的詳細轉錄組分析，并識別ETs轉錄因子SpiB，它是驅動M細胞分化程序[10]的一個關鍵因素。接著，B細胞被認為引發基底氣囊的形成，并通過CD137-CD137L相互作用[7]誘導前體M細胞功能性成熟。因此，根據M細胞在不同分化步驟的受損，上皮細胞可能會出現一些特征性的M細胞，但不是功能性抗原提呈細胞。因此，對M細胞分化程序更深入的了解才有可能促進體內M細胞功能的實驗調制。

2 M細胞的結構

M細胞攝取轉運功能的發揮與其特殊的結構特點密切相關。在腸道中吸收上皮細胞和M細胞(非吸收性的上皮細胞)通過緊密連接(TJs)互連，從而形成一個相對不可滲透的限制外來物質吸收的屏障。但在結構上M細胞與腸上皮細胞有顯著區別：其表面的糖被層厚度僅為20 nm，明顯低于腸上皮細胞的400 nm。M細胞頂端缺乏刷狀緣，有利于與腸腔內容物的接觸和黏附；M細胞頂端呈圓頂狀，M細胞基底層凹陷形成“口袋樣”結構，其頂部及周邊胞質很薄，這樣縮短了外源物質的跨胞轉運距離，該結構中含有豐富的淋巴細胞及少量巨噬細胞、樹突狀細胞，有利于抗原物質快速進入上皮下淋巴組織，從而誘導黏膜免疫應答，胞質中含有大量的吞飲小泡，M細胞的基底膜常常是不連續的，可允許淋巴細胞自由穿過[11]；與腸道其他細胞不同，M細胞具有降低的蛋白酶活性和較少糖萼，這樣可以保持外源物質轉胞后的特性較少改變[12]。

3 M細胞的功能

在腸道，已經發現的抗原提呈細胞包括M細胞、巨噬細胞、樹突細胞、杯狀細胞。M細胞有很強的轉胞容量，并能傳輸多種類型的材料，如細菌、病毒和抗原，從而誘導管腔底層淋巴組織發生免疫應答[13-15]。Rios等[16]研發了一種特殊實驗小鼠，這種小鼠腸道上皮Tnfrsf11a有條件地缺失，從而使RANKL依賴的M細胞分化的受體激活劑無效。他們用這種小鼠來研究腸道M細胞在取樣抗原從而刺激分泌SIgA作為對腸道細菌的免疫應答中的角色和作用。腸道無M細胞的小鼠，表現出PP中的生發中心(germinal center,GC)成熟明顯延遲和固有層的IgA漿細胞的出現顯著延遲，導致在成年小鼠糞便的SIgA的水平減弱持續存在。分析RANKL缺失小鼠腸道SIgA的反應，認為在促進GALT對共生菌群的抗原提呈，從而啟動SIgA的生產，維持具有豐富定植共生菌群的上皮組織免疫動態平衡等方面，M細胞有舉足輕重的作用。納米粒和細菌可引起M細胞頂膜皺裂和肌動蛋白細胞骨架的重排，繼而被細胞吞噬[17]。病毒等則通過網格蛋白包被小泡被M細胞內吞。麥胚凝集素(WGA)則通過受體介導被內吞。M細胞通過吞噬、胞吞、胞飲和跨胞轉運等多種機制將腸腔中的外源性大分子物質運送至腸道固有層。在腸道，病原體可以把M細胞作為穿過上皮屏障的門戶[18]。

M細胞表面存在一些重要的病原體識別受體(PRRs)，如血小板活化因子受體(PAFR)、Toll受體4(TLR-4)、α5β1-整合素、CD155及小窩蛋白-1[19]等在小鼠和人的M細胞表面都有表達[20]。PRRs與細菌的病原相關分子模式(PAMPs)，如肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸和細菌鞭毛蛋白分子等相互作用，構成消化道內抗原或病原微生物轉位的關鍵。Ma等[21]開發脂質脂球體(PLGA)，且觀察到脂質球體顯示出比裸的PLGA粒子模型更高的M細胞轉胞效率。Fievez等[22]研究表明，基于甘露糖修飾或肽類似物的納米顆粒顯示出比正常精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的納米顆粒更有效的胞轉和口服接種。Mishra等[23]研究表明，外源凝集素錨定的PLGA納米微粒經口服抗原傳遞可能引起強烈的黏膜和全身免疫反應。Yoo等[24]確定了CKSTHPLSC肽(CKS9)，這種肽通過噬菌體吞噬侵染的便利強化殼聚糖納米粒子的跨M細胞轉胞。所述CKS9殼聚糖綴合物還用于裝飾多孔PLGA微粒遞送豬痢疾疫苗，誘導黏膜和系統免疫應答[25]。

顆粒物質的直徑影響M細胞對顆粒物質的轉運，當微球粒徑<5 μm時，易于PP吸收進入全身淋巴組織循環，導致全身免疫，產生大量IgG；當粒徑位于5～10 μm時，經PP吸收后，滯留其中，最終導致SIgA的生成；當微球粒徑>10 μm時，被PP吸收得很少[26]。因此，直徑為1～10 μm的抗原微球進入腸道后，既可以產生全身免疫反應，也可以在病原容易入侵的黏膜部位產生局部免疫反應。此外，Wang等[27]發現，合成的載入介孔二氧化硅納米顆粒(BSA)具有130 nm、430 nm和1～2 mm的尺寸，并發現，在430 nm顆粒納米是最有效的口服免疫及引發全身和黏膜免疫應答。

4 AIEC經M細胞途徑致CD的相關研究

研究[28]表明，CD是一種腸道慢性反復發作的自身免疫性疾病。其特征為腸道免疫功能的失調，其確切的發病機制還未完全闡明，目前認為感染、遺傳、環境及免疫異常共同參與了CD的發病。浦江等[29]對CD患者和正常對照組進行透射電鏡、掃描電鏡觀察對比發現，CD回腸黏膜圓丘頂部M細胞數量較正常對照組明顯增多，可見較多M細胞頂面隆起，淋巴細胞由頂面破裂的M細胞突入腸腔。他認為，腸道病原體、抗原的慢性刺激與機體免疫異常，可能是導致CD患者腸道黏膜淋巴濾泡增生、M細胞顯著增多的原因。已經證實，復發性CD的最早病變為PP的糜爛[30]。

細菌參與炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的發病機理，但機制知之甚少[31]。在CD患者腸道黏膜，貼壁AIEC數量的增加已經在回腸和結腸被發現。此外，研究[32]發現，AIEC持續侵入腸上皮細胞并在其中繁殖，它們通常表達于M細胞轉運相關的長極菌毛基因A(lpfA)，因此，M細胞途徑更可能是細菌用于體內侵入的主要初始路由。此外，研究[30]報道，在AIEC功能lpf操縱子的存在下，細菌編碼長極性菌毛，它允許AIEC細菌與PP相互作用并跨越M細胞易位。Prorok-Hamon等[33]研究發現，結腸黏膜相關afa-1陽性AIEC的數量在CD和結腸癌(CRC)增加。最近一項研究發現，在小腸M細胞頂面表達的糖蛋白-2(GP-2)是表達FimH抗原的細菌如大腸埃希菌、傷寒沙門菌等特異性的轉胞吞受體[34]。研究還發現，具有Ⅲ型分泌系統的大腸埃希菌在M細胞中的轉運速率也有明顯的提高[35]。當大腸埃希菌表達Ⅰ型菌毛時其亞單位FimH能特異性黏附在M細胞的膜蛋白GP2糖基化的甘露糖殘基，從而誘導M細胞對大腸埃希菌的轉運[36]。研究認為，AIEC分泌各種促血細胞凝集素，侵入上皮細胞系，在巨噬細胞內繁殖，跨越M(微皺)細胞易位和損傷的DNA[33]。

綜上所述，M細胞具有其獨特的結構和功能，M細胞轉運抗原是啟動黏膜免疫應答重要的第一步[37]。在M細胞的“口袋”中，淋巴細胞能很快地與進入的抗原發生作用，從而引起一系列的系統免疫調節。M細胞增生、破裂這種細胞學水平的病理損傷在AIEC引起的CD早期發病機制中可能發揮重要作用。綜合關于M細胞起源、結構、功能、M細胞在CD早期的病理變化及AIEC經M細胞途徑致CD相關研究，可以看出M細胞在AIEC致CD的過程中起關鍵性作用。M細胞可能作為AIEC入侵腸黏膜的第一門戶，當M細胞被破壞后腸上皮屏障被破壞，這是CD多米諾骨牌效應的第一步。接下來抗原對機體的長期反復刺激，腸上皮局部反復的炎癥反應，腸上皮細胞、M細胞等反復的增生，反復的被破壞，腸上皮對損傷的纖維修復，這樣促成CD的發生、發展。綜合所有研究觀點，本文推測了AIEC作用于M細胞引起CD的可能機制(見圖1)。

圖1 AIEC作用于M細胞引起CD的可能機制

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(責任編輯：馬 軍)

Research progress of M cell and AIEC caused Crohn’s disease by M cell-mediated pathway

YANG Houlai, SUN Huawen, SUN Keming, WANG Qiushuang

Department of Gastrointestinal Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China

M cells, with special morphological structure, are a kind of immune cells in the gut, and also a kind of special antigen-transporting cells, and are closely related to the intestinal mucosal immune function. At an early stage of Crohn’s disease (CD), the presence of M cells proliferation and pathological fracture damage of cytology existed. This article will review literatures about M-cell origin, morphological structure, functions, and adherent-invasive Escherchia coli (AIEC) caused CD by M cell-mediated pathway in recent years.

M cell; Origin; Morphological structure; Function; Crohn’s disease; AIEC

國家自然科技基金資助項目(81170368)

楊厚淶，在讀研究生，住院醫師，研究方向：炎癥性腸病。E-mail: 420528a24yg.cdb@sina.cn

孫華文，主任醫師，博士，研究方向：炎癥性腸病。E-mail： Sunhuawen888@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.07.027

R574.62

A

1006-5709(2017)07-0819-04

2016-08-01