近紅外熒光分子探針在胃癌分子成像中的應用研究

賀 玲， 屈亞威， 王偉岸， 夏憫馨， 劉海峰

1.安徽醫科大學，安徽 合肥 230032；2.武警總醫院消化內科

近紅外熒光分子探針在胃癌分子成像中的應用研究

賀 玲1,2， 屈亞威2， 王偉岸2， 夏憫馨2， 劉海峰2

1.安徽醫科大學，安徽 合肥 230032；2.武警總醫院消化內科

目的 評估3種近紅外熒光分子探針在胃癌分子成像中的靶向性和熒光效應，為胃癌熒光分子成像篩選可用的靶向分子探針。方法 選用3種近紅外熒光分子探針(IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST)，并以吲哚菁綠作為對照組，經裸鼠胃癌皮下移植瘤模型尾靜脈注射探針后進行活體熒光分子成像，量化分析腫瘤部位熒光信號強度。離體熒光分子成像觀察探針的生物分布和代謝。成像結束后，對移植瘤進行組織學及3種探針相應分子靶點(αvβ3、FRα、MMP)免疫組織化學檢測。結果 活體熒光分子成像結果顯示探針(IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST)均在荷瘤鼠腫瘤部位出現濃聚，濃聚高峰分別在注射后1 h、1 h、24 h。與對照組相比，上述3種分子探針有較好的靶向性和信噪比。離體熒光分子成像證實探針主要經肝、腎代謝。免疫組化表明3種探針對應的分子靶點在裸鼠胃癌皮下移植瘤均有表達。結論 以上3種探針可用于胃癌熒光分子成像。αvβ3、FRα、MMP可作為胃癌熒光分子成像的靶點。

近紅外；熒光分子成像；胃癌；探針；鼠模型

目前，早期胃癌及癌前病變的檢測主要依賴白光內鏡觀察病變及活檢后的病理定性，而多數早癌形態結構變化不明顯且病變活檢定位缺乏準確性，導致漏診率很高[1]。近年來，將熒光分子成像(fluorescence molecular imaging, FLI)與消化內鏡融合形成的熒光分子內窺成像技術得到了迅猛發展，有望成為早期胃癌檢測技術的新突破。熒光內窺成像通過靜脈注射或表面噴灑熒光探針靶向病變區域，然后用相應的設備激發使病變部位“發光”，進而捕捉到熒光信號并對病變進行觀察和檢測，使得在內鏡下進行消化道腫瘤分子診斷成為可能，其效果相當于在體免疫組織化學檢查，同時也能指導腫瘤的靶向治療[2]。

要想實現熒光分子內窺成像在早期胃癌診斷中的臨床轉化，必須有能和腫瘤細胞或細胞間質靶向性結合的熒光分子探針。因此開發特異性強、靶向性好、無毒的熒光探針成為研究熱點。另外，對比可見光波段的熒光成像，近紅外熒光成像擁有更強的組織穿透性和更高的信噪比[3]。故本實驗選用近紅外窗的3種商業化靶向性熒光探針(IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST)，利用臨床可用的非靶向性熒光探針吲哚菁綠(indocyanine green, ICG)作對照，對胃癌裸鼠皮下移植瘤模型進行活體和離體FLI，并對腫瘤組織進行相應的抗原抗體免疫組化檢測，從而驗證這3種探針在胃癌分子成像中的靶向性和熒光效應，為日后研發臨床可用的胃癌靶向性熒光分子探針助力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST探針購自美國PerkinElmer公司；ICG購自遼寧天醫生物制藥公司；PBS、RPMI 1640培養基購自美國Gbico公司；異氟烷購自山東科源制藥公司；鼠抗人αvβ3單抗原液購自美國NOVUS公司；鼠抗人MMP2單抗、鼠抗人FRα單抗購自北京西雅金橋生物公司。

1.1.2 主要儀器：IVIS?Spectrum小動物活體成像儀購自美國PerkinElmer公司，小動物氣體麻醉裝置購自美國Caliper公司。

1.1.3 細胞株：人胃癌細胞SGC-7901購自中國醫學科學院細胞中心，由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所腫瘤藥理室傳代、保存。

1.1.4 實驗動物：4～6周齡Bal b/c裸鼠，SPF級，體質量18～22 g，雌性，購自北京維通利華公司。受試動物飼養于無菌的獨立送風IVC籠中，用專門為小鼠配制的消毒飼料、瓜子、純凈水飼喂。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：SGC-7901細胞接種于含100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養基(含青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，置于體積分數為5%的CO2、37 ℃培養箱中培養，2.5 g/L胰蛋白酶消化、傳代。

1.2.2 裸鼠胃癌皮下移植瘤模型構建：將處于對數期的SGC-7901細胞用胰酶消化、離心(1 200 r/min,5 min)，生理鹽水洗滌后重懸，調整細胞濃度為3×107ml-1。16只裸鼠分別于右側腋下接種0.2 ml單細胞懸液，待腫瘤長至0.8～1.0 cm備用。

1.2.3 成像前準備：(1)配制探針：IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST、ICG凍干粉溶于無菌PBS中，4 ℃避光保存；(2)麻醉：異氟烷持續吸入麻醉至裸鼠四肢無力。

1.2.4 活體FLI：16只荷瘤鼠，分4組，每組4只，每組荷瘤鼠依次尾靜脈注射2 nmol/100 μl IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST、ICG，注射探針前、后1 h、3 h、7 h、24 h、48 h利用IVIS?Spectrum進行FLI，Living Image軟件分析圖像，以腫瘤部位為中心，直徑10 mm的圓形區域劃感興趣區域(region of interest, ROI)，測量各時間點ROI的平均熒光信號強度。

1.2.5 離體FLI：待以上荷瘤鼠體內探針完全代謝后(約4 d)，重新分別尾靜脈注射2 nmol/100 μl IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST、ICG，各探針在瘤體濃聚高峰時和探針注射后48 h分別處死各組荷瘤鼠，剝離瘤體及主要臟器(心、肝、脾、雙腎)，用PBS洗滌后，再用上述方法立即進行FLI，測量其平均熒光信號強度。

1.2.6 組織學檢查：離體FLI結束后，腫瘤組織經病理學檢查，明確組織類型，并行各探針對應靶點免疫組化(immunohistochemistry，IHC)檢測驗證各探針的特異性。

2 結果

2.1 活體FLI 連續動態FLI結果顯示，尾靜脈注射各探針后，隨著時間的推移，與ICG相比，3種靶向性探針逐漸在皮下移植瘤濃聚，小動物活體成像儀能在瘤體探測到明顯的熒光信號，與鄰近正常組織對比明顯。量化瘤體平均熒光信號強度可見3種探針(IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST)在腫瘤濃聚高峰時間不一，依次為探針注射后1 h、1 h、24 h。而ICG注射后主要聚集在肝臟，48 h后完全排出體外，持續成像沒有在瘤體探測到明顯的特異性熒光信號(見圖1～2)。

2.2 離體FLI 探針在瘤體濃聚高峰時以及探針注射后48 h對腫瘤及主要臟器(心、肝、脾、雙腎)進行離體FLI，量化各臟器平均熒光信號強度，獲得各探針在裸鼠胃癌移植瘤模型的代謝及組織分布情況。MMPSenseTM750FAST和IntergriSenseTM750經肝、腎同時代謝，而FolateRsenseTM680主要經腎臟代謝，探針注射后48 h在瘤體仍能探測到熒光信號，但均較代謝器官(肝臟或腎臟)弱。ICG主要聚集在肝臟，注射后48 h經肝、腎代謝后完全排出體外(見圖3～4)。

2.3 組織學檢查結果 裸鼠胃癌皮下移植瘤進行組織學和3種靶向性探針所對應靶點(αvβ3、FRα、MMP)的IHC檢測。HE染色證實該移植瘤為胃癌，3種特異性熒光探針IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680和MMPSenseTM750FAST各自對應的分子靶點αvβ3、FRα和MMP在移植瘤均有不同程度表達(見圖5)。

圖1 裸鼠胃癌皮下移植瘤模型活體熒光分子成像圖Fig 1 Subcutaneous xenograft models in vivo fluorescence imaging

圖2 特異性熒光探針與ICG在腫瘤部位平均熒光信號強度隨時間變化圖

Fig 2 The fluorescence intensity of the specific probes and ICG in the tumor site changes over time

3 討論

基于熒光靶向性探針的胃癌熒光分子成像能在病變形態結構改變前，從分子水平識別和描述病變的在體黏膜特征[6]。胃癌發生、發展過程中有一些高表達的分子可以作為腫瘤診斷的候選靶點，比如胃癌特異性抗原(MG7、MGb2)[4-5]，細胞表面的一些特異性受體(如：整合素[6]、表皮生長因子受體[7]、血管內皮生長因子受體[8]、肝細胞生長因子受體[9]等)，或蛋白水解酶(基質金屬蛋白酶[10]、組織蛋白酶B[11]等)及一些小分子受體(葉酸受體α[12])等。熒光分子探針能與這些靶點特異性結合高亮腫瘤從而實現病變的熒光檢測。目前基于靶向性熒光分子探針的胃癌成像仍停留在動物和人離體組織標本研究階段。2012年，Hoetker等[13]用熒光染料AlexaFlour488標記西妥昔單抗構建了靶向表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的熒光探針，經尾靜脈注射該探針到裸鼠胃癌皮下移植瘤模型體內，利用共聚焦激光顯微內鏡(confocal laser endomicroscopy, CLE)在荷瘤鼠瘤體上觀察到西妥昔單抗組熒光強度明顯高于對照組，并在亞細胞水平定位了EGFR的分布。MG7抗原是第四軍醫大學課題組發現的一種特異性較高的胃癌相關抗原，在胃癌組織中表達率高達94%，在胃癌患者血清中的檢出率為83.6%，是極具早期診斷價值的胃癌分子標志物[4]。2013年，Li等[4]將AlexaFlour488標記的抗MG7單克隆抗體與新鮮人胃癌組織及正常胃組織體外共孵育后利用CLE檢測，結果顯示23例胃癌組織標本中22例有特異性熒光信號，而非癌組織標本則無或僅有弱熒光信號。

熒光內窺成像技術向臨床轉化的最大阻礙就是靶向性熒光探針在人體應用的安全性。因此，開發臨床可用的靶向性探針將會是胃癌熒光內窺成像研究中的重要方向。整合素αvβ3作為細胞黏附分子和細胞表面受體，它在胃癌表面和新生血管內皮細胞中的表達上調，通過特定的信號轉導通路削弱細胞與細胞之間或細胞與基質之間的黏附并影響腫瘤細胞的生長和凋亡，參與腫瘤血管生成、侵襲和轉移[6]。整合素能促進基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)的表達，MMP通過降解腫瘤周圍的基質而促進細胞轉移，其活性增強或表達上調與胃癌浸潤轉移有著密切關聯[10]。葉酸受體α(folate receptor α, FRα)是一種細胞表面蛋白，已被證實為一種新的腫瘤標記物，在多種實體瘤(包括胃癌)中高表達[12]。另外，由于活體內的血紅蛋白、水和脂質對600～900 nm的近紅外熒光的吸收率最低，與可見光相比，近紅外熒光成像擁有更深的組織穿透性且自體熒光干擾少[10]。

注：圖中1、2、3、4、5分別指腫瘤、心臟、肝臟、脾臟、雙腎。圖3 組織離體FLI圖 A: αvβ3; B: FRα; C: MMP; D: ICGFig 3 Ex vivo FLI of tissue A: αvβ3; B: FRα; C: MMP; D: ICG

注：圖中1、2、3、4、5分別指腫瘤、心臟、肝臟、脾臟、雙腎。

圖4 探針在瘤體濃聚高峰時以及探針注射后48 h的組織分布圖 A: ICG; B: IntergriSenseTM750; C: FolateRsenseTM680; D: MMPSenseTM750FAST

Fig 4 The distribution of the probe at the peak tumor concentration and 48 hours after the injection of the probe A: ICG; B: IntergriSenseTM750; C: FolateRsenseTM680; D: MMPSenseTM750FAST

圖5 裸鼠胃癌皮下移植瘤HE染色和免疫組化結果圖(400×) A: HE; B: αvβ3; C: FRα; D: MMP

Fig 5 HE staining and immunohistochemical analysis of transplanted tumors in nude mice (400×) A: HE; B: αvβ3; C: FRα; D: MMP

本實驗選用αvβ3、FRα、MMP作為胃癌熒光分子成像的目標靶點，利用與上述靶點對應的近紅外靶向熒光分子探針(IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST)進行胃癌的熒光診斷成像。活體FLI和離體FLI結果顯示，尾靜脈注射各探針后，探針立即全身分布，與ICG相比，3種靶向性探針逐漸在皮下移植瘤濃聚，小動物活體成像儀能在瘤體探測到明顯的熒光信號，與鄰近正常組織對比明顯。量化分析ROI平均熒光信號強度證實探針IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST在腫瘤濃聚高峰時間不一，依次為注射后1 h、1 h、24 h。注射后48 h在瘤體仍能探測到熒光信號，但均較代謝器官(肝臟或腎臟)弱。而ICG注射后主要在肝臟聚集，48 h后經肝臟代謝、經腎臟完全排出體外，持續成像沒有在瘤體探測到明顯的特異性熒光信號。本實驗首次證明，這3種特異性熒光分子探針對胃癌具有良好的靶向性，并且成像清晰、定位準確。免疫組化提示，各探針對應靶點在裸鼠皮下移植瘤中表達均陽性。結合熒光分子成像和免疫組化結果證實FRα、αvβ3和MMP可以作為熒光分子成像診斷胃癌的特異性靶點，這3種近紅外商業探針也可應用于胃癌的熒光診斷研究。

荷瘤鼠持續活體FLI和離體臟器FLI證實上述靶向探針在注射后48 h，除移植瘤外，其他部位仍可見強度不一的熒光信號，提示與瘤體未結合的探針仍未完全排除體外，這可能與探針分子量大，代謝緩慢，血清半衰期長有關。如果探針全身應用后易在體內積累，會增加背景噪音，降低腫瘤病變的信噪比，影響活體成像效果。在后續研究中，可以以這些靶點為基礎，篩選出分子量更小的配體(如短肽[14]、核酸適體[15]等)，與熒光物質結合，構建出藥代動力學及組織分布特性更優秀的胃癌靶向性熒光探針。目前，胃癌熒光分子成像依舊處于臨床前研究階段，而食管和結腸瘤變已有人在體FLI研究成果報道[16-18]。相信在不久的將來，胃癌熒光分子診斷也會取得突破性進展。

[1]李兆申, 鄒文斌. 如何提高內鏡下早期胃癌的診斷水平[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2016, 25(6): 601-604. Li ZS, Zou WB. Optimizing early gastric cancer detection under gastroscopy [J]. Chin J Gastroenterol Hepatol, 2016, 25(6): 601-604.

[2]Li M，Wang TD. Targeted endoscopic imaging [J]. Gastrointest Endosc Clin N Am， 2009， 19(2): 283-298.

[3]Goetz M, Wang TD. Molecular imaging in gastrointestinal endoscopy [J]. Gastroenterology, 2010, 138(3): 828-833, e1.

[4]Li Z, Zuo XL, Li CQ, et al. In vivo molecular imaging of gastric cancer by MG7 antigen with confocal laser endomicroscopy [J]. Endoscopy, 2013, 45(2): 79-85.

[5]Qiao R, Liu C, Liu M, et al. Ultrasensitive in vivo detection of primary gastric tumor and lymphatic metastasis using upconversion nanoparticles [J]. ACS Nano, 2015, 9(2): 2120-2129.

[6]Boger C, Warneke VS, Behrens HM, et al. Integrins alphavbeta3 and alphavbeta5 as prognostic, diagnostic, and therapeutic targets in gastric cancer [J]. Gastric Cancer, 2015, 18(4): 784-795.

[7]Higaki E, Kuwata T, Nagatsuma AK, et al. Gene copy number gain of EGFR is a poor prognostic biomarker in gastric cancer: evaluation of 855 patients with bright-field dual in situ hybridization (DISH) method [J]. Gastric Cancer, 2016, 19(1): 63-73.

[8]Chen J, Zhou SJ, Zhang Y, et al. Clinicopathological and prognostic signifcance of galectin-1 and vascular endothelial growth factor expre-ssion in gastric cancer [J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(13): 2073-2079.

[9]Hwang DW, Bahng N, Ito K, et al. In vivo targeting of c-Met using a non-standard macrocyclic peptide in gastric carcinoma [J]. Cancer Lett, 2017, 385: 144-149.

[10]Ding S, Eric Blue R, Chen Y, et al. Molecular imaging of gastric neoplasia with near-infrared fluorescent activatable probes [J]. Mol Imaging, 2012, 11(6): 507-515.

[11]Gao W, Xua J, Wang F, et al. Mitochondrial proteomics approach reveals voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1) as a potential biomarker of gastric cancer [J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 37(6): 2339-2354.

[12]Assaraf YG, Leamon CP, Reddy JA. The folate receptor as a rational therapeutic target for personalized cancer treatment [J]. Drug Resist Updat, 2014, 17(4-6): 89-95.

[13]Hoetker MS, Kiesslich R, Diken M, et al. Molecular in vivo imaging of gastric cancer in a human-murine xenograft model: targeting epidermal growth factor receptor [J]. Gastrointest Endosc, 2012, 76(3): 612-620.

[14]Zhang D, Jia H, Wang Y, et al. A CD44 specific peptide developed by phage display for targeting gastric cancer [J]. Biotechnol Lett, 2015, 37(11): 2311-2320.

[15]Song Y, Zhu Z, An Y, et al. Selection of DNA aptamers against epithelial cell adhesion molecule for cancer cell imaging and circulating tumor cell capture [J]. Anal Chem, 2013, 85(8): 4141-4149.

[16]Sturm MB, Joshi BP, Lu S, et al. Targeted imaging of esophageal neoplasia with a fluorescently labeled peptide: first-in-human results [J]. Sci Transl Med, 2013, 5(184): 184ra61.

[17]Burggraaf J, Kamerling IM, Gordon PB, et al. Detection of colorectal polyps in humans using an intravenously administered fluorescent peptide targeted against c-Met [J]. Nat Med, 2015, 21(8): 955-961.

[18]Liu J, Zuo X, Li C, et al. In vivo molecular imaging of epidermal growth factor receptor in patients with colorectal neoplasia using confocal laser endomicroscopy [J]. Cancer Letters, 2013, 330(2): 200-207.

(責任編輯：馬 軍)

Application of near infrared fluorescent molecular probe in molecular imaging of gastric cancer

HE Ling1,2, QU Yawei2, WANG Weian2, XIA Minxin2, LIU Haifeng2

1.Anhui Medical University, Hefei 230032; 2.Department of Gastroenterology， General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, China

Objective To evaluate the targeting ability and fluorescence efficiency of three kinds of near infrared fluorescent probes in molecular imaging of gastric cancer， and to screen useful molecular probes for fluorescence molecular imaging of gastric cancer. Methods Three kinds of near infrared fluorescent molecular probes (IntergriSenseTM750， FolateRsenseTM680, MMPSenseTM750FAST) were used to detect and quantify the fluorescent signal intensity of tumor tissue by in vivo fluorescent molecular imaging after injecting of the above probes to subcutaneous xenograft models of gastric cancer. The biodistribution and metabolism of these probes were performed by exvivo fluorescence molecular imaging. After fluorescence molecular imaging, the histologic examination of the transplanted tumor tissue and the immunohistochemical detection of the corresponding molecular targets (αvβ3, FRα, MMP) were performed. Results In vivo fluorescence molecular imaging showed that three kinds of probes (IntergriSenseTM750, FolateRsenseTM680, MMPSenseTM750FAST) were concentrated in the tumor-bearing tumor, and the peak was 1 hour, 1 hour and 24 hours after injection, respectively. Furthermore, compared with control group, the region of interest of the three targeted fluorescect probes were better. In vitro fluorescence molecular imaging confirmed that the probes was mainly metabolized by the liver and kidney.Immunohistochemistry confirmed that three molecular targets were expressed in subcutaneous xenografts models. Conclusion The above mentioned molecular probes can be used for the fluorescence molecular imaging of gastric cancer. αvβ3, FRα and MMP can be used as targets for imaging of gastric cancer.

Near infrared; Fluorescence molecular imaging; Gastric cancer; Probe; Mouse model

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.07.019

國家自然科學基金項目(81471700)

賀玲，碩士研究生，研究方向：消化道消腫瘤熒光分子成像的研究。E-mail: 18516889540@163.com

劉海峰，研究方向：消化道腫瘤的早期診斷研究。E-mail:haifengliu333@163.com

R735.2

A

1006-5709(2017)07-0786-05

2017-03-21