培養基不同營養水平對一株植物乳桿菌發酵生長及保存的影響

張崢，張戈，楊蓉，龍宣杞

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區科技發展戰略研究院烏魯木齊 830052；3.新疆農科院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091)

培養基不同營養水平對一株植物乳桿菌發酵生長及保存的影響

張崢1，張戈2，楊蓉3，龍宣杞3

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區科技發展戰略研究院烏魯木齊 830052；3.新疆農科院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091)

【目的】研究培養基營養水平對一株植物乳桿菌生長以及對菌液保存過程中活菌數的影響，為植物乳桿菌的發酵生產和保存提供理論參考。【方法】用分光光度儀測定液體振蕩培養條件下，植物乳桿菌的生長曲線，并確定在培養基不同營養水平下植物乳桿菌的對數生長末期、平穩期中期、平穩期末期，用硫酸-蒽酮法測定相應的殘糖含量和活菌數，并測定液體振蕩培養后靜置保存過程中的活菌數。【結果】在30 h的液體振蕩培養中，植物乳桿菌在富營養、正常和寡營養三種營養水平條件下，該菌的生長曲線都經歷了遲緩期、對數期、穩定期，未見到衰亡期。寡營養水平下，植物乳桿菌最大活菌數達到最高水平，達到1012cfu/mL以上。在靜置過程中，三種發酵培養液中活菌數持續下降。在靜置30 d時，三種水平下的活菌數都保持在1010cfu/mL以上。在此之后，寡營養和正常水平培養基中活菌數快速下降，而富營養培養基中活菌數仍處于較高水平，直至靜置60 d后仍保持在1010cfu/mL以上。【結論】三種營養水平下，植物乳桿菌生長曲線類似，在寡營養水平下，發酵液中的活菌數最高，富營養水平則更有利于發酵液中活菌的長時間保存。在進行液體深層發酵生產時，可以采用寡營養水平，以利于提高活菌數；發酵完成后可補充營養利于活菌的保存。

植物乳桿菌；生長曲線；菌液保存

0 引 言

【研究意義】植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，革蘭氏陽性，最適生長溫度為30～35℃，厭氧或兼性厭氧,菌種為直或彎的桿狀，單個、有時成對或成鏈狀，最適pH 6.5左右，屬于同型發酵乳酸菌。植物乳桿菌對人體有特殊的生理作用, 且在食品[1]、 飼料[2、3]及醫療保健[4]領域中占重要地位。隨著科學的發展, 研究的不斷深入, 人類對植物乳桿菌生理功能的研究發現在不斷增多, 使用乳桿菌菌株的范圍也在不斷擴大, 其應用領域也在不斷增多。【前人研究進展】我國從20世紀50年代開始對植物乳桿菌相關的基礎理論及應用進行研究，進入21世紀后更是成為了研究熱點。目前，通過各個方面對植物乳桿菌的生長和保存進行研究。華寶珍等[5]通過單因素試驗分析了大豆多肽添加量、葡萄糖酸錳添加量、嗜熱鏈球菌的接種量和發酵溫度對植物乳桿菌ST-Ⅲ活菌數的影響。劉書亮等[6]對植物乳桿菌P158進行了生長曲線分析，發現培養36 h時生物量達到最大值,約為1011cfu/mL。余樂[7]報道了植物乳桿菌發酵劑的貯藏溫度和貯藏時間對菌體存活率的影響。司淼菲[8]研究了噴霧干燥法和真空冷凍干燥法對制備植物乳桿菌直投式發酵劑的影響,結果表明真空冷凍干燥法制備的植物乳桿菌直投式發酵劑的菌種存活率、儲藏性和活菌數含量都較高。【本研究切入點】隨著植物乳桿菌應用領域的不斷擴大，它在加工、運輸過程中的失活問題也日益突出[9]，制約了其在生產生活中的應用。通過對菌株培養基營養水平的改變,研究營養水平對植物乳桿菌生長和保存的影響。【擬解決的關鍵問題】研究培養基營養水平對一株植物乳桿菌生長以及對菌液保存過程中活菌數的影響，尋找有利于其生長和保存的營養水平，為植物乳桿菌的應用提供一定的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株

實驗菌株植物乳桿菌由新疆農業科學院微生物應用研究所提供。

1.1.2 培養基與試劑

正常水平發酵培養基：蔗糖 20 g，酵母粉 12 g，蛋白胨 10.5 g，磷酸二氫鉀 0.2 g，硫酸鎂 0.2 g，硫酸錳 0.04 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；

寡營養發酵培養基：正常水平降低25%；

富營養發酵培養基：正常水平升高25%；

MRS固體培養基：蔗糖 20 g，酵母粉 12 g，蛋白胨 10.5 g，磷酸二氫鉀 0.2 g，硫酸鎂 0.2 g，硫酸錳 0.04 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；

蒽酮試劑：溶解0.2 g蒽酮于100 mL濃硫酸(A.R.95.5%)中，當日配制使用。

標準糖試劑：0.1 g/L葡萄糖溶液。

1.1.3 主要儀器

高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3020(新德醫療器械有限公司)，紫外分光光度計UV-2550(日本島津自動化設備有限公司)，搖床ZHWY-100D(上海智城儀器制造有限公司)，DK-8D電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)：PHs-3C酸度計(上海雷磁儀器廠)，AEL_160島津電子天平(日本島津自動化設備有限公司)，電熱恒溫培養箱DHP-9162(上海-恒科學儀器有限公司)，超凈工作臺SW-CJ-2FD(上海精密儀器儀表有限公司)，CP214通用型分析天平(山東博科生物產業有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 菌種活化

將在-20℃保存的菌種于冰浴中溶解， 然后用無菌接種環在MRS固體培養基中劃線培養，于35℃恒溫培養箱中培養5～7 d ，使菌種復壯。將復壯后的菌種接種至多只MRS斜面培養基上，在35℃恒溫培養箱中培養24 h。將斜面置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 生長曲線測定

向備用斜面中加入7 mL滅菌水。將菌體充分混勻后，分別向富營養、正常和寡營養水平的200 mL 發酵培養基中加入2 mL菌液，于35℃、120 r/min條件下，發酵培養30 h。在培養過程中，每2 h(2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 h、......)分別取樣，總菌數用分光光度法(波長600 nm)測吸光度值(OD)，以相應的空白培養基溶液為對照，每次三個重復。以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制作生長曲線。根據生長曲線確定三種不同營養水平下植物乳桿菌的對數生長末期、平穩期中期、平穩期末期。

1.2.3 殘糖量的測定

葡萄糖標準曲線測定：分別取0.1 g/L的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 mL，用蒸餾水補到1.0 mL，對照加入1.0 mL蒸餾水，分別加入4.0 mL蒽酮試劑，迅速進入冰水中冷卻，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發。自水浴重新煮沸開始計時，準確煮沸10 min。冷卻后，用分光光度法(波長620 nm)測吸光度值(OD)。以光密度為縱坐標，糖的含量微克數為橫坐標，制作標準曲線。

用與1.2.2相同的方法，將菌種接種至200 mL 三種發酵培養基中，于35℃、120 rmp條件下進行培養。在1.2.2中確定的各個時間點取樣，測其OD值。并取1.0 mL樣品溶液，進行1 000倍稀釋后，取稀釋液1.0 mL，一式3份分別置于不同試管中，對照加入1.0 mL蒸餾水，然后給各管加入4 mL蒽酮試劑，以標準曲線方法進行比色測定。根據標準曲線和樣品OD值計算殘糖含量。

1.2.4 不同營養水平下生長及保存中菌液活菌數測定

不同培養基濃度下，在植物乳桿菌生長的對數期末期、平穩期中期、平穩期末期分別吸取1 mL菌液至9 mL滅菌水的試管中，搖勻，做梯度稀釋至10-9，取10-7、10-8、10-9梯度進行涂布，35℃培養18 h，計數，確定菌液中的活菌數。此后，將發酵菌液常溫下靜置，分別在10、20、30、45和60 d以相同方法測定活菌數。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌在三種營養條件下的生長曲線

植物乳桿菌的生長周期一般分為調整期、對數期、穩定期和衰亡期。從圖1中可以直觀地看出，植物乳桿菌在寡營養和正常水平培養基下，調整期為0～4 h，之后進入對數期，至12 h以后進入穩定期，培養到30 h未見到衰亡期；植物乳桿菌在富營養條件下，調整期同樣是0～4 h，對數期稍有延長，為4～14 h，14 h以后進入穩定期，培養至30 h也未見到衰亡期。在穩定期，寡營養條件下植物乳桿菌活菌數一直處于最高水平；在穩定期中后期，富營養和正常水平下活菌數相當。活化后的植物乳桿菌在不同營養水平的發酵培養基中表現的生長曲線差異并不顯著，但在同樣條件下寡營養更適合植物乳桿菌的生物量積累。

可以選定寡營養和正常水平下，LP-2對數生長末期、平穩期中期、平穩期末期分別為12、21、30 h；富營養水平下，LP-2對數生長末期、平穩期中期、平穩期末期分別為14、22、30 h。圖1

圖1 植物乳桿菌在三種營養條件下生長曲線
Fig.1 Growth curve ofLactobacillusplantarumunder three nutrient

2.2 植物乳桿菌在三種營養條件下的殘糖含量

根據葡萄糖標準曲線測定方案，繪制出葡萄糖標準曲線，由圖中可知，其擬合方程為：

Y=0.006 5X,R2=0.995 6

其中Y為吸光值OD520，X為葡萄糖含量(μg/mL)。圖2

研究表明，在三種營養水平的發酵培養基中，殘糖濃度隨著植物乳桿菌的生長而降低，其中在寡營養水平下，葡萄糖濃度下降最多，富營養次之，正常水平降低最少。這與三種營養水平下植物乳桿菌的生長曲線表現一致。圖3

圖2 葡萄糖標準曲線
Fig.2 Standard curve of glucose

圖3 植物乳桿菌三個生長期殘糖含量
Fig.3 Residual sugar content ofLactobacillusplantarumduring three growing periods

2.3 不同營養水平下生長及保存中菌液活菌數

根據2.1中所測生長曲線結果顯示，選定寡營養和正常水平下，植物乳桿菌對數生長末期、平穩期中期、平穩期末期分別為12、21、30 h；高濃度條件下，對數生長末期、平穩期中期、平穩期末期分別為14、22、30 h。

在對數生長末期、平穩期中期、平穩期末期分別對三種營養水平下的植物乳桿菌進行平板計數。平板計數結果為三種濃度水平的三個時期，其活菌數都在1011cfu/mL以上。寡營養條件下，活菌數一直處于最高水平，并在穩定期中期達到1012cfu/mL以上。這與殘糖測定結果和生長曲線表現都一致，說明了寡營養更適合植物乳桿菌的生長。圖4

經過30 h的震蕩培養后，植物乳桿菌活菌數隨靜置時間的變化可以直觀的看到，隨著靜置時間的延長，三種營養水平下的其活菌數都出現下降。寡營養水平下，植物乳桿菌的起始活菌數最高，其活菌數變化也最顯著，其次為正常水平，富營養水平菌體數量變化緩慢。在靜止30 d時，三種營養水平下，植物乳桿菌活菌數都處于1010cfu/mL以上；之后，寡營養和正常水平下其活菌數下降至1010以下，而富營養水平下，其活菌數直到靜止60 d時活菌數仍保持在1010以上。因此，富營養水平更有利于植物乳桿菌的長時間保存。圖5

圖4 植物乳桿菌三個生長期活菌數
Fig.4 The viable cell count ofLactobacillusplantarumduring three growing periods

圖5 保存過程中植物乳桿菌活菌數
Fig.5 The viable cell count ofLactobacillusplantarumduring storage

3 討 論

培養基是人工配制的供微生物生長繁殖和合成各種代謝產物所需的、一定比例的多種營養物質的混合物。它的組成對菌體的生長繁殖、產物的生物合成、產品的分離精制乃至產品質量和產量都有重要影響。目前，已有大量培養基對植物乳桿菌生長及保存影響方面的研究[10、11]。從培養基營養水平角度研究其對植物乳桿菌生長和保存的影響。生長曲線、活菌計數以及葡萄糖含量變化的研究結果都表明寡營養水平更適合于植物乳桿菌的生長。因此，在生產中可以采用寡營養濃度培養基，以降低生產成本。研究中植物乳桿菌在寡營養條件下12 h即達到對數生長期末期，與劉書亮等[5]的研究結果22 h和楊永亮等[12]的研究結果18 h均有很大差異，這可能與菌種、培養基、接種量以及培養條件都有關系，有待于進一步的研究。

在發酵液保存過程中會出現活菌數下降的現象，實驗針對此現象研究不同營養水平對活菌數的影響。結果發現，在靜置過程中，三種營養水平下植物乳桿菌活菌數持續下降，但在富營養條件下活菌數下降趨勢較緩，且一直處于較高水平。因此，富營養水平更利于植物乳桿菌發酵液的長期保存。但這與研究中寡營養水平更適合于其生長的結論不一致。因此，應當根據實際需要選擇合適的營養水平進行生產或保存。

4 結 論

在30 h的液體振蕩培養中，植物乳桿菌在三種營養水平條件下的生長曲線類似，都經歷了遲緩期、對數期、穩定期，未見到衰亡期。寡營養水平下，植物乳桿菌在12 h即達到對數生長期末期，并且最大活菌數處于最高水平，達到1012cfu/mL以上。在靜置過程中，三種發酵培養液中活菌數持續下降。在靜置30 d時，三種水平下的活菌數都保持在1010cfu/mL以上。在此之后，寡營養和正常水平培養基中活菌數快速下降，而富營養培養基中活菌數仍處于較高水平，直至靜置60 d后仍保持在1010cfu/mL以上。由此可知，培養基不同營養水平對植物乳桿菌發酵生長及保存的存在影響。在寡營養水平下，發酵液中的活菌數最高，富營養水平則更有利于發酵液中活菌的長時間保存。在進行液體深層發酵生產時，可以采用寡營養水平，以利于提高活菌數；在生產結束前可向發酵液中補充營養，以便于活菌的保存。

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Effects of Different Nutritional Levels on the Growth and Preservation of a Strain Medium：Lactobacillusplantarum

ZHANG Zheng1, ZHANG Ge2, YANG Rong3, LONG Xuan-qi3

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，XinjiangUniversity，Urumqi830046，China； 2.XinjiangAcademyofScienceandTechonlogyforDevelopment，Urumqi830046，China； 3.ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091，China)

【Objective】 The purpose of this study is to investigate the effects of nutrient level on the growth and viability of a strain ofLactobacillusplantarum, and to provide theoretical reference for the production and preservation ofL.plantarum.【Method】The growth curve ofL.plantarumunder liquid shake culture was measured with spectrophotometer in order to determine the end of logarithmic phase, the meddle and the late of stationary phase under different nutrient levels. The corresponding residual sugar content was determined by the sulfuric acid-anthrone method, and viable count in the process of saving was also measured.【Result】In the period of 30 hr and under liquid shake culture condition, the growth curve of the bacterial was observed with a lag phase, logarithmic phase and s
Table phase, but decline phase was not found in all nutritional conditions. The highest level of viable count occurred under the nutrient level of oligotrophic, which was 1012cfu/mL. During standing preservation after liquid shake culture, viable count continued to decline in the three fermentation broths, which remained above 1010cfu/mL at 30thday. But after that, viable count in the oligotrophic and normal medium decreased rapidly, while it was still at a high level and remained above 1010cfu/mL even after being saved for 60 days in the eutrophic medium.【Conclusion】The results showed that the growth curves ofL.plantarumwere similar under the three nutrient levels. The highest level of viable count occurred under the oligotrophic level, while the eutrophic level was more favorable for the preservation of viable bacteria. Therefore, the oligotrophic level can be used for fermentation to increase viable count, and nutrition can be added after fermentation to facilitate the preservation of viable bacteria.

Lactobacillusplantarum; growth curve; bacteria preservation

LONG Xvan-qi (1969- ), female, native place: Sichuan. Researcher, research field: Soil Microorganism and Microecology. (E-mail) longxq_xj@sina.com.

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.06.018

2017-04-11

自治區科技成果轉化專項資金項目“設施農業多價復合菌劑的示范推廣”(201554113) ；新疆農業科學院青年基金項目(xjnkq-2015027)

張崢(1991-)，男，河南人，碩士研究生，研究方向為食品生物技術，(E-mail)1132641757@qq.com

龍宣杞(1969-)，女，四川人，研究員，研究方向為土壤微生物與微生態學，(E-mail)longxq_xj@sina.com

S188

A

1001-4330(2017)06-1108-06

Supported by: Project supported by special fund for transformation of scientific and technological achievements of the autonomous region "demonstration of facility agriculture multivalent microbial agents"(201554113)； the Youth Funds of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences (xjnkq-2015027)