鹽酸?？颂婺釋θ朔切〖毎伟〩CC827細胞凋亡及EGFR下游信號通路蛋白表達的影響

李磊 鐘敏鈺 宋海斌

·論著·

鹽酸?？颂婺釋θ朔切〖毎伟〩CC827細胞凋亡及EGFR下游信號通路蛋白表達的影響

李磊 鐘敏鈺 宋海斌

目的 探討鹽酸?？颂婺?Icotinib)對人非小細胞肺癌(NSCLC)HCC827細胞凋亡及EGFR下游信號通路蛋白表達的影響。方法 通過噻唑藍比色(MTT)法檢測Icotinib對HCC827細胞增殖的影響，流式細胞儀觀察Icotinib對HCC827細胞凋亡的誘導作用，采用蛋白質免疫印跡(Western blot)檢測表皮生長因子受體(EGFR)、蛋白激酶B(AKT)、胞外信號調節激酶(ERK)、p-EGFR、p-AKT、p-ERK和Survivin等EGFR下游信號通路蛋白的表達水平。結果 Icotinib抑制HCC827細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用具有濃度依賴性和時間依賴性(P<0.05)；隨著Icotinib對HCC827細胞作用的藥物濃度升高，p-EGFR、p-AKT、p-ERK和survivin等EGFR下游信號通路蛋白的表達水平均明顯下調(P<0.05)。結論Icotinib可能通過抑制EGFR下游信號通路蛋白的表達，進而有效抑制HCC827細胞的增殖和誘導HCC827細胞的凋亡。

鹽酸埃克替尼；非小細胞肺癌；凋亡；表皮生長因子受體

肺癌是發病率較高的惡性腫瘤疾病，由于臨床上缺乏靈敏且有效的早期診斷指標，大多數肺癌患者確診時已處于晚期階段，而上述患者僅能采取放化療或靶向性治療[1]。近些年隨著研究人員對靶向性治療認識的不斷深入，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epider-mal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)已成為治療晚期非小細胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)的新型措施，而表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)突變患者療效更為顯著[2]。鹽酸?？颂婺?Icotinib)是一種新研制而成的EGFR-TKI，可特異性和競爭性的與EGFR酪氨酸激酶功能區相互結合，進而有效抑制其生理活性功能，最終起到阻斷腫瘤細胞增殖、凋亡等相關信號傳導通路的藥理作用[3-5]。本研究擬探討Icotinib對人非小細胞肺癌HCC827細胞凋亡及EGFR下游信號通路蛋白表達的影響，為Icotinib的臨床應用提供有利的實驗依據。

1 資料與方法

1.1 研究細胞及實驗試劑 人非小細胞肺癌HCC827細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心，Icotinib購自浙江貝達藥業有限公司，RPMI-1640培養液購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物公司，四甲基偶氮唑(MTT)購自華美生物公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BD公司，兔抗人EGFR、蛋白激酶B(AKT)、胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p-EGFR、p-AKT、p-ERK和Survivin抗體均購自Cell Signaling公司。

1.2 細胞培養方法 HCC827細胞由本實驗室根據常規方法在RPMI 1640培養液(內含10%濃度的胎牛血清、12 kU/L濃度的慶大霉素)，37℃、飽和濕度及5%CO2的孵育箱內進行傳代培養，0.25%胰酶消化液予以消化傳代，每間隔2～3 d傳代一次。

1.3 MTT檢測方法 將生長良好的HCC827細胞制備成細胞懸液，使得細胞濃度為1×105/ml，在培養板中依次進行接種，每孔加入90 μl細胞懸液，分別在每孔內加入Icotinib培養液，使孔內Icotinib藥物終濃度為0.1、1 μmol/L。另設陰性對照組及空白組，各設置6個復孔進行對比研究。在細胞培養箱中分別培養24、48、72 h后，加入100 μl體積的MTT溶液，室溫條件下培養4 h后離心處理后吸棄上層細胞培養液，然后將100 μl體積的DMSO依次加入每孔，與孔內液體充分溶解15 min。采用A570nm對每孔的OD值進行檢測，并計算細胞生長抑制率。

1.4 細胞凋亡率檢測 采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒對細胞凋亡率進行檢測，具體方法按照試劑盒說明書進行操作。取對照組與0.1、1 μmol/L Icotinib藥物濃度處理8 h、16 h和24 h的HCC827細胞，PBS溶液洗滌2次，調整細胞濃度為1×106/ml，吸取100 μl細胞溶液到EP管，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI試劑相互混勻，室溫避光孵育15 min，然后加入400 μl×Binding buffer，1 h內送流式細胞儀予以檢測。

1.5 蛋白質免疫印跡(Western blot)檢測蛋白表達 將對數生長期的HCC827細胞接種在6孔板(2×105個/孔)，待細胞培養貼壁后分別加入藥物濃度為0.1和1 μmol/L的Icotinib。藥物作用24 h后收集HCC827細胞，裂解處理后12 000 r/min離心25 min，吸取細胞上清液，采用Western blot對EGFR、AKT、ERK、p-EGFR、p-AKT、p-ERK和Survivin蛋白予以定量檢測。與3×樣品緩沖液混合均勻后，在94℃溫度條件下加熱處理10 min，將樣品予以SDS-PAGE電泳，從凝膠組織中將蛋白質物質轉移至濾膜上，電泳轉印處理后行Western Blot檢測，一抗以1∶200予以稀釋處理，二抗則以1∶750予以稀釋處理，采用DAB試劑盒顯色處理，如有蛋白質條帶出現立即用大量PBS溶液沖洗以終止Western Blot反應過程，實驗結果采用專用掃描儀器分析和處理，目的蛋白/GAPDH的灰度比值表示其蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1Icotinib對HCC827細胞增殖的影響 隨著Icotinib藥物濃度的逐漸增加，其抑制HCC827細胞增殖的作用逐漸增強(P<0.05)；隨著Icotinib作用時間的延長，其抑制HCC827細胞增殖的作用也逐漸增強(P<0.05)。見表1，圖1。

Icotinib濃度(μmol/L)生長抑制率24h48h72h空白對照組0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.124.02±6.18△38.10±7.51*△47.34±8.23*#△150.44±8.95△☆61.41±10.74*△☆72.25±9.92*#△☆

注：與24h比較，*P<0.05；與48h比較，#P<0.05；與空白對照組比較，△P<0.05；與0.1μmol/L比較,☆P<0.05

圖1 3組不同時間點細胞生長抑制率比較

2.2Icotinib對HCC827細胞凋亡的誘導作用 隨著Icotinib藥物濃度的逐漸增加，其誘導HCC827細胞的凋亡率逐漸升高(P<0.05)；隨著Icotinib作用時間的延長，其誘導HCC827細胞的凋亡率也逐漸升高(P<0.05)。見表2，圖2。

Icotinib濃度(μmol/L)凋亡率8h16h24h空白對照組0.00±0.001.12±0.25*3.46±0.55*#0.17.62±2.65△10.27±3.71*△15.30±5.04*#△113.56±5.41△☆18.20±5.30*△☆23.16±5.92*#△☆

注：與8 h比較，*P<0.05；與16h比較，#P<0.05；與空白對照組比較，△P<0.05；與0.1μmol/L比較,☆P<0.05

2.3Icotinib對HCC827細胞EGFR下游信號通路蛋白表達的影響 隨著Icotinib對HCC827細胞作用的藥物濃度升高，p-EGFR、p-AKT、p-ERK和survivin等EGFR下游信號通路蛋白的表達水平均明顯下調(P<0.05)。見表3，圖3。

圖2 3組HCC827細胞不同時間凋亡的流式細胞圖

圖3 3組HCC827細胞EGFR下游信號通路蛋白的表達(Western Blot)

Icotinib濃度(μmol/L)EGFR/GAPDHp-EGFR/GAPDHERK/GAPDHp-ERK/GAPDHAKT/GAPDHp-AKT/GAPDHSurvivin/GAPDH空白對照組0.978±0.1980.925±0.2100.728±0.1920.637±0.1420.870±0.1810.963±0.2610.826±0.189 0.10.957±0.1750.725±0.127*0.712±0.1550.471±0.086*0.854±0.1670.772±0.195*0.682±0.125* 10.921±0.1430.502±0.105*#0.707±0.1440.328±0.051*#0.821±0.1650.437±0.096*#0.414±0.087*#

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與0.1μmol/L組比較，#P<0.05

3 討論

人類EGFR是Erb/HER家族的一個成員，與肺癌發生密切相關，在肺癌組織中常高表達，從而促進了腫瘤血管生成、腫瘤細胞增殖、粘附、侵襲和轉移。EGFR可在胞外相應配體的誘導作用下形成同源/異源二聚體，進而促進酪氨酸激酶的自磷酸化過程，明顯激活活化下游的多條信號傳導通路，最終對腫瘤細胞異常增殖、凋亡現象、遠處轉移及血管組織形成等予以有效調節和控制[6,7]。目前已知EGFR有RAS/MAPK/ERK和PI3K/AKT兩條主要的信號傳導通路等，EGFR的突變可使得其生理學活性功能顯著性增強，進而持續激活活化處于下游的各種信號傳導通路，有效刺激腫瘤細胞的異常增殖，在腫瘤疾病的發生、發展過程中占有十分重要的作用[8-10]。Icotinib是由我國研究人員最新研制而成的EGFR-TKI，在化學結構和作用機制等方面與吉非替尼、厄洛替尼等藥物具有較高的相似性，且治療效果無明顯差異性，具有更高的安全可靠性[4]。Icotinib可有效抑制EGFR的自身磷酸化作用，從而明顯阻止下游信號通路的激活活化過程。此外，Icotinib還可特異性和競爭性的結合EGFR酪氨酸激酶功能區，從而有效抑制其生理學活性功能，最終對腫瘤細胞增殖及凋亡等信號傳導通路予以有效阻斷[11,12]。本研究結果顯示，隨著Icotinib藥物濃度的逐漸增加和作用時間的延長，其抑制HCC827細胞增殖的作用和誘導HCC827細胞的凋亡率均明顯增強和升高，提示Icotinib抑制HCC827細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用具有濃度依賴性和時間依賴性(P<0.05)，此結果與國內外相關研究相符[7,13,14]。此外，還有研究為明確Icotinib在分子水平的激酶抑制選擇性，檢測其對88種激酶(包括EGFR-TK及其突變型)的抑制活性，結果顯示鹽酸埃克替尼僅對EGFR-TK及其突變型有顯著抑制作用[15]。

本研究還發現，隨著Icotinib作用濃度的升高，p-EGFR、p-AKT、p-ERK和survivin等EGFR下游信號通路蛋白的表達水平均明顯下調。由此可知，Icotinib有效抑制了EGFR的自身磷酸化及EGFR下游信號通路蛋白的表達，進而有效抑制HCC827細胞的增殖和誘導HCC827細胞的凋亡。本研究還存在某些不足，如Icotinib對其他正常細胞的毒性作用，Icotinib抑制人非小細胞肺癌HCC827細胞增殖和誘導凋亡的最佳劑量，這些均需要進一步深入研究。

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The influence of icotinib hydrochloride on apoptosis of non-small cell lung cancer cell-HCC827 and the protein expression levels of EGFR downstream signaling pathways in vitro

LILei,ZHANGMinyu,SONGHaibin.

DepartmentofOncology,TheFirstHospitalofWuhanCity,Wuhan430022,China

Objective To investigate the influence of icotinib hydrochloride on apoptosis of non-small cell lung cancer cell (NSCLC)-HCC827 and the protein expression levels of EGFR downstream signaling pathways in vitro.Methods The influence of icotinib hydrochloride on proliferation of HCC827 cell was detected by MTT,and the effects of icotinib-induced apoptosis of HCC827 cell were observed by flow cytometry,moreover, the expression levels of EGFR signaling pathways downstream proteins including epidermal growth factor receptor (EGFR),protein kinase B (AKT),extracellular signal regulating EGFR kinase (ERK),p-EGFR,p-AKT,p-ERK and Survivin were detected by Western Blot.Results The icotinib hydrochloride had inhibitory effects on HCC827 cell proliferation and could induce apoptosis of HCC827,with a concentration dependent and time dependence manner (P<0.05).With the increase of icotinib concentration,the expression levels of EGFR signaling pathways downstream protein including p-EGFR,p-AKT,p-ERK and Survivin were significantly down-regulated (P<0.05).Conclusion The icotinib hydrochloride can effectively inhibit HCC827 cell proliferation and induce apoptosis of HCC827 cells by inhibiting the expressions of EGFR signaling pathways downstream protein.

icotinib hydrochloride; non-small cell lung cancer; apoptosis; epidermal growth factor receptor

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.17.006

430022 湖北省武漢市第一醫院腫瘤科三病區

R

A

1002-7386(2017)17-2585-04

2017-04-17)