2型糖尿病性牙周病患者唾液中白細胞介素6含量測定①

劉陸濱,趙禹仲,孫啟菲,趙 亮

(佳木斯大學附屬口腔醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

2型糖尿病性牙周病患者唾液中白細胞介素6含量測定①

劉陸濱,趙禹仲,孫啟菲,趙 亮

(佳木斯大學附屬口腔醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：測定2型糖尿病性牙周病患者口腔唾液中白細胞介素6(IL-6)的含量。方法：利用Bio-Plex 懸液芯片技術分別測量2型糖尿病性牙周病患者和健康人唾液IL-6含量。結果：2型糖尿病性牙周病患者唾液中IL-6的含量(3.88±0.24)pg/L，健康人唾液IL-6含量(2.78±0.31)pg/L，二者之間有顯著性差異(P<0.05)。結論：利用口腔唾液中IL-6的含量評價2型糖尿病性牙周病患者的嚴重程度是可行的。

糖尿病性牙周病；唾液；白細胞介素6(IL-6)；Bio-Plex；懸液芯片技術

糖尿病是一種嚴重威脅人類健康的內分泌系統疾病[1]。近年來隨著人們生活質量的提高和餐飲質量的變化，2型糖尿病患者的發病率也逐年增加。研究發現[2]，近5年來其發病率由占全國慢性病第7位上升到第3為。牙周病是口腔科常見疾病之一，在我國人群的患病率較高[3,4]。它是一類牙齒支持組織的慢性炎癥性疾病，多發生于牙齦、牙周膜等部位。牙周病被認為是糖尿病的第六大并發癥[5]，炎癥被認為是糖尿病的危險因子，可影響胰島素抵抗和代謝控制，通過生活方式或治療降低炎癥水平可降低糖尿病進一步發展的風險性[6]。白細胞介素6(IL-6)是主要炎癥介質，它在唾液和齦溝液中的濃度是牙周病及糖尿病的活動性指標，與治療有著密切的關系。本次研究擬對糖尿病性牙周病患者和健康人唾液中IL-6含量進行測定，探討兩組研究對象中唾液中IL-6含量變化規律以及與糖尿病性牙周病發生的關聯性。

1 材料與方法

1.1 主要材料

微珠(240μL 25×stock beads加入5760μL Bio-Plex Assay Buffer)，檢測抗體(60μL 50×Stock Detection Antibody加入2940μL Detection Antibody Diluent A)和Streptavidin-PE 熒光色素(60μL 100×Streptavidin-PE加入5940μL Bio-Plex Assay Buffer)。

1.2 實驗分組及樣本采集

通過篩查居民健康檔案，分別選擇2型糖尿病性牙周病人和健康人各40例作為實驗組和對照組。實驗組納入標準：2糖尿病性牙周病患者符合臨床診斷標準，無糖尿病并發癥，婦女未處于懷孕期及哺乳期；半年內未做過牙周基礎治療；最近3個月未服用過抗生素；全口無齲者；無抽煙者。對照組納入標準：全身無系統性疾病；婦女未處于懷孕期及哺乳期；半年內未做過牙周基礎治療；最近3個月未服用過抗生素；全口無齲者；無抽煙者。與實驗組和對照組參與者簽訂知情同意書，符合醫學倫理學要求。

采樣前夜采用Bass法刷牙，次日上午8時清醒空腹情況下進行標本采集。唾液采集采用經典的非刺激性全唾液采集法，每人采集唾液99μL，加入保護液1μL，干冰保溫盒中保存。待樣本采集完畢，冰浴解凍。

1.3 實驗方法

實驗流程按照Bio-Plex pro assay說明書進行。

(1)打開Bio-Plex System系統并校正。真空吸板機的真空度調節為1～2Hg壓力，用96孔板蓋住。(2)將標準品稀釋后加入96孔板中，然后加入微珠。輕輕蓋上封板膜和鋁簿，使每個小孔完全遮住。室溫下以1100r/s下振動30s，再以600轉/秒下振動30min。(3)振動結束后，以100μL Bio-Plex Assay Buffer潤濕濾板，輕輕打開封板膜和鋁簿，用100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸凈以防止交叉污染。(4)每孔加入50μL標準品，輕輕蓋上封板膜和鋁薄，使每個小孔完全遮住。室溫下以1100r/s下振動30s，再以600r/s下振動30min。然后將封板膜和鋁薄打開，過程中要避免濺出，真空抽去buffer，再100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸凈以防止交叉污染。(5)漩渦振動檢測抗體數秒，每孔加入detection antibodies25μL，輕輕蓋上封板膜和鋁簿，使每個小孔完全遮住。室溫下以1100r/s下振動30s，再以600r/s下振動30min。然后將封板膜和鋁薄打開，過程中要避免濺出，真空抽去buffer，再100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸凈以防止交叉污染。(6)漩渦混合Streptavidin-PE 熒光色素，每孔加入50μL，輕輕蓋上封板膜和鋁簿，使每個小孔完全遮住。室溫下以1100r/s下振動30s，再以600r/s下振動30min。然后將封板膜和鋁薄打開，過程中要避免濺出，真空抽去buffer，再100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸凈以防止交叉污染。(7) 每孔加入125μL Bio-Plex assay buffer 微珠重懸，輕輕用密封袋蓋住，1100轉室溫搖床30秒后立即放入儀器中進行讀盤檢測。

1.4 統計學方法

采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，將數據輸入該軟件，計量資料以均數±標準差來表示，認為P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

實驗組與對照組中唾液中IL-6含量，兩組之間的差異有統計學意義(P<0.05)。患者唾液中的IL-6含量與糖尿病性牙周病患者有一定的關聯。見表1。

表1 實驗組、對照組唾液中IL-6含量

3 討論

人體是一個統一整體，任何一種疾病的發生都不是單一的組織器官的反應，在全身均有反應。唾液是口腔中特殊的微環境，它在口腔中作為液相自成一體，由口腔附近各類大小唾液腺的分泌液和齦溝液混合而成，其內混懸有食物碎片、微生物和口腔上皮脫落細胞。牙周病使得唾液中的細菌，特別是牙周袋深部的致病菌、厭氧菌獲得更多的營養物質，在充足營養物質供給的情況下，會使得細菌大量繁殖，導致牙齦組織中小血管基底膜增厚，減少局部供血及供氧，降低了局部的氧分壓，使得牙周袋內的厭氧環境進一步增強，使得致病菌大量繁殖。大量細菌繁殖的結果是局部炎癥加重，作為主要炎癥介質的白細胞介素6(IL-6)的生成大量增加。生成的白細胞介素6一部分通過血液循環進入到機體各部，一部分在牙周組織附近起作用，大幅度提高機體內白細胞介素6的水平，進而導致β細胞的功能和形態發生改變，影響胰島素的分泌，同時引起胰島素抵抗增強。由于減少了自身胰島素的分泌和胰島素抵抗的增強，使得機體內的糖代謝的影響進一步加劇。唾液中糖含量增加，局部炎癥加劇，主要炎癥介質白細胞介素6含量進一步增加。這與實驗結果相一致。

由于牙周組織的炎癥，使得牙周組織的通透性增加大量形成的白細胞介素6可以輕易通過牙周膜與牙槽相接觸，與通過血液循環聚集在牙槽骨中的白細胞介素6聚集，進一步增加牙槽骨中的濃度，而白細胞介素6又具有誘導破骨細胞生成的作用使得牙槽骨溶解，牙周袋加深，局部炎癥加重，生成更多的白細胞介素6。

Bio-Plex 懸液芯片技術是由最初的微球技術逐漸發展演變而來的，近年來為人類基因重組以及多種多樣的蛋白質組提供的一項新技術[7]。它整合了多種實驗技術并聯合運用計算機運算法則，其強大的分析能力優于傳統的ELISA技術，具有更加精準靈敏和寬廣的領域[8]。在當今和未來的基因工程測序中占有重要地位，也將成為臨床醫學診斷中發揮重要作用。

盡管本研究得出II型糖尿病性牙周病患者唾液中IL-6的含量顯著高于健康人群，但IL-6在2型糖尿病性牙周病患者胰腺、唾液腺以及牙周組織中的動態變化和相關聯動機制尚不清楚，有待于進一步研究。

[1]王瑾堃,劉中柱.尿L-FABP與LAP對2型糖尿病腎病早期診斷的意義[J].黑龍江醫藥科學,2016,39(4):138-139

[2]樊蕾,楊玉芝.2型糖尿病合并慢性淋巴細胞性甲狀腺炎對胰島素抵抗及冠心病的影響[J].黑龍江醫藥科學,2014,37(6):85-87

[3]李云霞.牙周病的病因及臨床治療研究進展[J].河北醫學, 2013, 19(3):166

[4]楊斯惠,鐘良軍.TH17細胞與牙周病相關性研究進展[J].口腔醫學研究,2013, 29(1):92

[5]Taylor G W, Borgnakke W S. Periodontal disease： Associations with diabetes, glycemic control and complications[J]. Oral Dis，2008，14(3)：191-203

[6]Lalla E， Papapanou P N. Diabetes mellitus and periodontitis: a tale of two common interrelated diseases[J]. Nat Rev Endocrinol，2011,7(12):738-748

[7]劉天龍,王燕飛,鄒明強,等.懸液芯片系統在檢測領域的研究進展[J].中國畜牧獸醫,2011,38(2): 84-87

[8]林田心，黃慧姝.開發利用于Bio-Plex懸液芯片系統抗IL-17A的單克隆抗體[J].生物技術世界,2013,4(3):16

Highlights: Objective: Detection the content of interleukin 6 (IL-6) in oral saliva of patients with type II diabetes mellitus. Method: Determine the content of the IL-6 in saliva of patients with type II diabetes and periodontal disease was measured by Bio-Plex suspension chip technique. Result :The content of IL-6 in saliva of patients with type II diabetes mellitus was (3.88±0.24)pg/L, and the content of IL-6 in saliva of healthy people was about (2.78±0.31)pg/L, so there was significant difference between the two groups (P<0.05). Conclusion: it is feasible to evaluate the severity of patients with type II diabetes mellitus by using the content of IL-6 in oral saliva.

Type 2 diabetic patients with periodontal disease determination content of interleukin 6 in saliva

LIULu-bin,ZHAOYu-zhong,SUNQi-fei,ZHAOLiang

(Stomatology Hospital Affiliated to Jiamusi University，Jiamusi 154002，China)

diabetes mellitus;saliva;interleukin 6 (IL-6);Bio-Plex suspension chip technique

黑龍江省衛生廳課題，編號：2012-231。

劉陸濱(1971～)男，黑龍江佳木斯人，學士，副教授，主任醫師。

孫啟菲(1987～)女，山東泰安人，在讀碩士研究生。E-mail：805038871@qq.com。

R587.1

B

1008-0104(2017)04-0011-02

2017-03-13)