MTHFR基因多態(tài)性在黑龍江東部地區(qū)腦卒中患者的頻率分析①

王 超，于 蓮，季方茹，雷力力

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科,黑龍江 佳木斯 154003)

MTHFR基因多態(tài)性在黑龍江東部地區(qū)腦卒中患者的頻率分析①

王 超1，于 蓮1，季方茹2，雷力力2

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科,黑龍江 佳木斯 154003)

目的：分析黑龍江省東部地區(qū)健康人群和腦卒中患者中5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR) C677T、A1298C基因多態(tài)性的分布情況。方法：在黑龍江東部地區(qū)選取225例腦卒中患者和169例健康人群為測(cè)試對(duì)象，檢測(cè)其MTHFR C677T、A1298C位點(diǎn)的基因多態(tài)性，統(tǒng)計(jì)并分析黑龍江東部地區(qū)基因多態(tài)性的分布特征。結(jié)果：MTHFR C677T基因型中健康組與腦卒中組人群的基因攜帶頻率之間無(wú)顯著性差異(χ2=2.269，P>0.05)。MTHFR A1298C基因型中2組人群基因頻率沒(méi)有顯著性差異(χ2=0.159，P>0.05)。C677T和A1298C兩個(gè)基因位點(diǎn)之間連鎖后的9種基因型在2組人群中無(wú)顯著性差異(χ2=8.202，P>0.05)。結(jié)論：我省東部地區(qū)MTHFR C677T、A1298C的3中基因類型在健康組與腦卒中組人群中沒(méi)有差異性，C677T和A1298C基因型組合在2組人群中無(wú)差異性，腦卒中患者的發(fā)病因素可能不僅與基因型有關(guān)，其他不確定因素進(jìn)一步導(dǎo)致了其發(fā)病率。

亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態(tài)性；腦卒中

腦卒中(cerebral stroke)是以腦血管病變而引起的高致殘率、高致死率的疾病，尤其患有高血壓、糖尿病等高危因素的人群中其發(fā)病率明顯上升。目前，我國(guó)腦卒中患者人數(shù)呈上升趨勢(shì)，而且趨于年輕化[1]。亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetrahydrofolate reductase MTHFR)是葉酸在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶，該酶的活性能直接影響人體內(nèi)血漿同型半胱氨酸的含量。通常MTHFR的兩個(gè)常見(jiàn)的突變基因位點(diǎn)是C677T和A1298C，這兩個(gè)基因位點(diǎn)的錯(cuò)義突變導(dǎo)致677位堿基C被T置換，1298位A置換為C從而改變了MTHFR的氨基酸結(jié)構(gòu)，影響了MTHFR酶的活性，最為顯著的表現(xiàn)為MTHFR酶活性下降，這就使得同型半胱氨酸無(wú)法正常完成向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化，從而造成血同型半胱氨酸的含量明顯升高[2]，進(jìn)而導(dǎo)致腦卒中的易感性。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)于MTHFR C677T和A1298C的研究有很多，種群、地域等因素導(dǎo)致研究結(jié)果不盡相同。然而，就目前對(duì)我國(guó)腦卒中高發(fā)地區(qū)之一的黑龍江東部地區(qū)，研究數(shù)據(jù)較少。同時(shí)對(duì)于以C677T和A1298C兩個(gè)基因位點(diǎn)作為相互關(guān)聯(lián)因素研究的數(shù)據(jù)為零。因此，本實(shí)驗(yàn)組擬定科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)方法，在黑龍江東部地區(qū)適宜人群中選取適宜樣本，探討MTHFR C677T和A1298C位點(diǎn)的基因多態(tài)性在健康人與腦卒中患者中的分布情況，為我省在精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展上提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持，指導(dǎo)臨床合理用藥，以減少腦梗死疾病和痛苦，達(dá)到合理預(yù)防、提高生存質(zhì)量的目的。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取黑龍江東部地區(qū)自2015-10～2016-02來(lái)我院進(jìn)行腦卒中檢查的人群，以及本實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取的健康人，其中健康人共計(jì)169例，腦卒中患者共計(jì)225例，均為漢族，平均年齡為(61.7±8.5)歲。腦卒中患者篩選的指標(biāo)均按照“全國(guó)第四屆腦血管會(huì)議制定的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)”執(zhí)行[3]，同時(shí)腦卒中患者都經(jīng)過(guò)本院MRI或(和)CT檢查并確診。

1.2 研究方法

基因型的檢測(cè)：本實(shí)驗(yàn)采用熒光染色原位雜交法對(duì)樣本基因進(jìn)行采集：①富集白細(xì)胞:取待測(cè)樣本200μL新鮮全血加入到1100μL氯化銨溶液中，混勻后室溫放置5min，然后離心機(jī)離心5min(3000r/min 700g) ，用移液槍吸取上清液，保留管底白細(xì)胞。②裂解保存:在富集白細(xì)胞的試管中加入50μL耀金保，用槍吹吸并震蕩試管混勻。③加樣:取1.5μL直接加入到待測(cè)基因?qū)?yīng)的耀金分試劑中，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Spss 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)數(shù)采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡

依據(jù)Hardy-Weinberg遺傳平衡，檢驗(yàn)采集到的MTHFR C677T、A1298C位點(diǎn)數(shù)據(jù)，健康組與腦卒中組理論頻數(shù)之間差異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采集的樣本具有群體代表性。

2.2 MTHFR基因多態(tài)

2.2.1 本省東部地區(qū)健康人群與腦卒中人群中MTHFR C677T的基因頻率分布比較是(表1)：C677T位點(diǎn)可分為CC基因型、CT基因型、TT基因型三種基因型，健康組中3種基因型頻率分別為20.7%、47.3%、32.0%，C和T等位基因頻率為44.4%、55.6%；腦卒中組的3種基因型頻率為13.3%、52.0%、34.7%，C和T等位基因頻率為39.3%、60.7%。兩組基因類型的總體分布頻率無(wú)顯著性意義(χ2=2.269，P>0.05)。兩組中C與T的等位基因頻率分布無(wú)顯著性意義(χ2=0.517，P>0.05)。

表1 MTHFR C677T的基因頻率分布[n(%)]

2.2.2 健康人群與腦卒中患者中MTHFR A1298C的基因頻率分布比較是(表2)：A1298C位點(diǎn)可分為AA基因型、AC基因型、CC基因型三種基因型，健康組中3種基因型頻率分別為58.6%、38.5%、2.9%，A和C等位基因頻率為77.8%、22.2%；腦卒中組的3種基因型頻率為57.8%、37.8%、4.4%，A和C等位基因頻率為76.7%、23.3%。兩組基因類型的總體分布頻率無(wú)顯著性意義(χ2=0.159，P>0.05)。兩組中A與C的等位基因頻率分布無(wú)顯著性意義(χ2=0.029，P>0.05)。

表2 MTHFR A1298C的基因頻率分布[n(%)]

2.2.3MTHFRC677T和A1298C兩個(gè)基因位點(diǎn)連鎖后的基因頻率分布比較(表3)。健康組中C677T與A1298C連鎖后的9中基因型頻率分別為CCAA9.5%、CCAC9.5%、CCCC1.8%、CTAA23.7%、CTAC23.1%、CTCC0.6%、TTAA25.4%、TTAC5.9%、TTCC0.6%，腦卒中組中兩種基因型連鎖后的頻率分別為CCAA4.4%、CCAC7.6%、CCCC1.3%、CTAA29.3%、CTAC19.6%、CTCC3.1%、TTAA24%、TTAC10.2%、TTCC0.4%。兩組基因類型的總體分布頻率無(wú)顯著性意義(χ2=8.202，P>0.05)。

表3 MTHFR C677T和A1298C連鎖后的基因頻率分布[n(%)]

3 討論

MTHFR基因位于人體染色體1p36.3，常見(jiàn)的研究類型有677C>T、1298A>C兩個(gè)位點(diǎn)[4]。目前，國(guó)內(nèi)外有大量的研究顯示，這2個(gè)基因位點(diǎn)堿基對(duì)的改變將直接導(dǎo)致MTHFR活性的降低，導(dǎo)致其反應(yīng)過(guò)程中甲基代謝能力的降低，進(jìn)而導(dǎo)致如同型半胱氨酸的升高[6]，同型半胱氨酸(Hcy)與腦血管疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。同時(shí)，其與心臟病、糖尿病等腦卒中發(fā)生的高危因素也有關(guān)聯(lián)[5]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，我省東部地區(qū)健康人群中與腦卒中患者M(jìn)THFR C677T和A1298C兩個(gè)基因位點(diǎn)的頻率之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。健康組與腦卒中組兩個(gè)基因位點(diǎn)中分別形成的3種基因類型具有相關(guān)性，沒(méi)有差異性。C677T和A1298C兩個(gè)位點(diǎn)連鎖后的9種基因型在健康組與腦卒中組中也沒(méi)有差異性。說(shuō)明我省東部地區(qū)MTHFR基因型分布沒(méi)有差異性，健康人群與腦卒中患者在發(fā)病率上與其攜帶的基因型沒(méi)有關(guān)聯(lián)。國(guó)內(nèi)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，MTHFR C677T和A1298C基因中突變型在健康人群和腦卒中患者中具有顯著差異，突變型基因會(huì)導(dǎo)致腦卒中危險(xiǎn)因素發(fā)生的概率[7]。然而，我省東部地區(qū)基因型之間沒(méi)有區(qū)別，說(shuō)明健康人群與腦卒中患者在發(fā)病原因可能因?yàn)槠渌蛩貙?dǎo)致。本省是我國(guó)腦卒中的高發(fā)地區(qū)之一，每年腦卒中患者呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，隨著分子生物學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，疾病與一些藥物相關(guān)的基因多態(tài)性之間的相關(guān)性研究越來(lái)越受關(guān)注[8～10]，如何有效、合理的知道患者用藥已經(jīng)成為醫(yī)療工作者面對(duì)的問(wèn)題。從基因?qū)用鎮(zhèn)€體化用藥，不僅能得到好的治療效果，更能減輕藥物的毒副作用，增加患者的耐受性。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果說(shuō)明我省東部人群體內(nèi)攜帶的MTHFR C677T和A1298C兩個(gè)位點(diǎn)的3中基因型較我國(guó)其他地方水平高，這可能會(huì)增加我省東部地區(qū)患腦卒中等相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

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佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：YM2016_097。

王超(1986～)男，山東青島人，在讀碩士研究生。

雷力力(1958～)女，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：leill888@126.com。

R743

A

1008-0104(2017)04-0048-03

2016-12-17)