D980nm激光不同治療頻次對SD大鼠皮膚緊膚效果的對比性研究①

黃信隆，張 威

(1.佳木斯大學研究生學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

D980nm激光不同治療頻次對SD大鼠皮膚緊膚效果的對比性研究①

黃信隆1，張 威2

(1.佳木斯大學研究生學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：研究經(jīng)過D980nm半導體激光不同治療頻次照射后，SD大鼠皮膚的膠原纖維、成纖維細胞、TGFβ1的變化，探討激光對大鼠皮膚緊膚效果的對比性變化，旨在作為D980nm半導體激光今后研究的實驗依據(jù)。方法：選取18只SD大鼠建立動物模型，分為I、II、III三組，每組6只，大鼠脊柱左側皮膚作為激光照射實驗組，脊柱右側皮膚作為自身對照組。調節(jié)D980nm半導體激光儀設定參數(shù)，在皮下照射SD大鼠脊柱左側皮膚，I組照射1次，II組照射2次，間隔2min，III組照射3次，間隔2 min，各組間隔1周處理一次，共3個療程。第3個療程結束休息1周后，引頸處死大鼠，背部皮膚脫毛取材切片，通過應用HE染色、免疫組化法，觀察激光照射前后大鼠皮膚膠原纖維和成纖維細胞變化，檢測分析TGFβ1表達在大鼠皮膚組織中的變化。結果：D980nm半導體激光進行皮下照射后大鼠皮膚膠原纖維含量增加、成纖維細胞數(shù)量增加、TGFβ1表達增強明顯，其中激光照射3次組，大鼠皮膚膠原纖維含量、成纖維細胞數(shù)量增加、TGFβ1表達增強明顯，定量分析與各組比較，有顯著性差異(P<0.01)。結論：經(jīng)D980nm半導體激光皮下照射后SD大鼠皮膚的緊膚效果明顯，合適的治療頻次可以提高皮膚的緊膚效果，并且緊膚效果強弱和治療頻次有關。

激光；緊膚；膠原纖維；成纖維細胞；TGFβ1

皮膚重塑一直以來在人類史上都是人們夢寐以求的目標，其治療技術發(fā)展層出不窮，從面部年輕化皮膚手術治療[1]，脂肪移植改善皮膚質地治療[2]，中藥改善瘢痕皮膚治療[3]，到現(xiàn)在激光重塑治療，其中激光在最近幾年發(fā)展迅速并用于治療皮膚光老化，尤其是D980nm波長半導體激光作為激光治療新模式在脂肪溶脂、改善瘢痕和治療光老化方面已證實有一定的效果，并在臨床治療中有初步的應用，但目前臨床上對于D980nm激光對皮膚起到緊膚效果的機制還有待進一步研究。而且，到現(xiàn)在為止激光的眾多研究多限制于臨床有效性的總結，而對其治療機制的基礎性研究甚少。并且臨床上，患者進行激光治療后，觀察其皮膚組織結構的變化并不是特別方便，其具體機制還有待深入研究[4～6]。在人類皮膚中起關鍵構造并且分布最為廣泛的細胞外基質成分是膠原纖維，關鍵是它確定了皮膚的強度和形態(tài)[7]。膠原由成纖維細胞合成，后者是作為皮膚真皮網(wǎng)織層中最主要的細胞[8]。較常見的有關創(chuàng)傷修復的細胞因子，主要是轉化生長因子β1 (TGFβ1)，并且它是促使成纖維細胞增殖分裂的重要細胞因子，其中TGFβ1是促進成纖維細胞增殖的主要因子[9]。目前，成纖維細胞、膠原纖維、TGFβ1細胞因子在D980nm波長半導體激光緊膚中的定量分析和評估至今鮮有報道。我們以SD大鼠建立動物模型，經(jīng)D980nm激光不同治療頻次后，觀察大鼠皮膚組織結構變化，并檢測分析成纖維細胞、TGFβ1因子在大鼠皮膚組織中的變化情況。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要儀器、試劑

隨機選取清潔級18只SD大鼠，雄性，體重400～450g，12～14個月齡，由佳木斯大學動物實驗中心供應飼養(yǎng)。德國塞拉姆D980激光治療儀(Ceramoptecgmbh公司，德國)。兔抗人TGFβ1多克隆抗體，SABC檢測試劑盒，均購于武漢博士德生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模方法

將SD大鼠18只，隨機標號分為3組，每組6只，標為I、II、III3組。激光前動物預備麻醉，對大鼠進行稱重計算所用麻醉劑量 (300mg/kg)，然后用10%的水合氯醛溶液以腹腔注射的方式進行充分的麻醉，待麻醉顯效后，實驗中以大鼠脊柱為分界線分為左右兩個對稱區(qū)域，每個區(qū)域為3cm×3cm，左側為實驗區(qū)域，常規(guī)脫毛、腫脹麻醉后，供使用D980nm激光對皮下組織進行處理，右側對稱部位為對照區(qū)域，只做常規(guī)脫毛、腫脹麻醉，不做其他處理。每側脫毛暴露區(qū)域為4cm×4cm。腫脹麻醉液：2%利多卡因1000mg+腎上腺素1mg+每升生理鹽水含10mL碳酸氫鈉。預標記區(qū)域皮下充分浸潤麻醉。將大鼠固定在實驗臺上。根據(jù)臨床、相關文獻和預實驗選出合適的激光嫩膚參數(shù)組合，脈沖模式下，采用D980nm波長行激光溶脂嫩膚，各實驗組能量密度均保持20J/cm2，功率為8W，脈沖寬度為20ms，脈沖頻率40Hz。I組用功率為8W的激光處理1遍，II組用功率為8W激光處理2遍，時間間隔為2min，III組用功率為8W的激光處理3遍，時間間隔為2min。各組每間隔1周處理一次，各組共3個療程，當?shù)?個療程后停歇恢復1周。在實驗組區(qū)域左下角作一直徑為1mm的圓形微小切口，把激光儀的光纖探頭套在金屬導管內(nèi)，把金屬導管穿過微小切口進入實驗組區(qū)域皮下脂肪組織進行均勻皮下照射，作用于皮膚真皮層和皮下脂肪層,用設計的實驗方法作用于實驗組，手術中用手持式紅外測溫槍監(jiān)督并檢測大鼠皮膚體表溫度變化，照射體溫要求小于42℃，手術后用冷凝膠均勻涂抹背部大鼠皮膚，并密切觀察大鼠的狀態(tài)。對照組不做處理。

1.2.2 標本取材、處理和染色

在大鼠第3個療程結束休息1周后，引頸處死大鼠，脫凈背部實驗組和對照組各標記區(qū)域的體毛，用組織剪快速剪下各組標記區(qū)域的皮膚組織塊，大小為1cm×1cm×0.5cm，標記清楚，在10%的中性福爾馬林中固定。 固定48h后，常規(guī)石蠟包埋后按每張5μm厚度作連續(xù)切片。每批次實驗均設陽性和陰性對照。陽性細胞判斷及計數(shù)：隨機選擇每組6張免疫組化染色切片，在每張組織切片中隨機選擇5個400倍的高倍細胞視野，以真皮成纖維細胞或巨噬細胞的包漿出現(xiàn)黃或黃褐色著色作為陽性表達，記錄每個視野中陽性表達的細胞總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 HE染色結果

各自身對照組：大鼠皮膚中膠原纖維數(shù)量較少，分散排列于真皮層中，且纖維之間空隙較大，成纖維細胞數(shù)目稀少(圖1X)。各實驗組間對比：I組為1次照射組顯示膠原纖維數(shù)量變多，纖維空隙減少，但雜亂排列，成纖維細胞增加不明顯(圖1I)；II組為2次照射組顯示膠原纖維數(shù)量上變多，纖維空隙略有減少，纖維增粗，似平行排布，成纖維細胞數(shù)量少量增加(圖1II)；III組為3次照射組顯示膠原纖維數(shù)量顯著變多，纖維間空隙減少，排列整齊有序緊密，成纖維細胞數(shù)目明顯增加(圖1III)。從D980nm激光照射治療后，實驗組與自身對照組相比較，膠原纖維含量增多明顯，形態(tài)上變粗，纖維間空隙減少，纖維排列緊密，走向與表皮平行分布，并且更加整齊有規(guī)則，成纖維細胞數(shù)量增多。見圖1。

圖1 D980nm激光不同治療頻次照射后皮膚膠原纖維和成纖維細胞變化 X.對照組(×100) I.1次照射組(×100) II.2次照射組(×100) III.3次照射組(×100)

2.2 TGFβ1表達結果

I、II、III三組治療頻次的激光進行皮下照射處理后，SD大鼠皮膚組織中的TGFβ1因子表達增強，其實驗組陽性細胞數(shù)目顯著高于自身對照組，并且有顯著性差異(P<0.01)。兩兩比較，I組實驗組和II實驗組比較，TGFβ1表達呈現(xiàn)明顯的差異，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，III實驗組數(shù)值結果顯示TGFβ1表達增強最明顯，與I、II實驗組比較，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1，圖2。

表1 D980nm激光不同治療頻次照射后大鼠 皮膚中TGFβ1表達結果

圖2 D980nm激光不同治療頻次照射后TGFβ1表達變化 X：對照組(×400) I：1次照射組(×400) II：2次照射組(×400) III：3次照射組(×400)

3 討論

半導體激光是高強度光源激光，皮膚組織中多種吸色團即靶目標可同時吸收一定的光能，產(chǎn)生多種光熱解效應，光熱解效應的一個原則是靶組織吸收足夠的熱量產(chǎn)生組織的熱損傷。組織損傷后即啟動創(chuàng)傷愈合過程[10]。在研究激光進行皮下照射時，當足夠的能量熱損傷達到一定程度后仍能發(fā)生局部炎癥反應，激光的熱損傷愈合過程與別的因素引起的創(chuàng)傷愈合過程有一定的共同性和特殊性，在該愈合修復進程中，皮膚膠原纖維、成纖維細胞和細胞因子變化規(guī)律是如何的。

在激光溶脂中，激光可直接破壞液化脂肪細胞，并且激光的熱效應能夠減少出血，促進皮膚收緊。最早JA Muccini，F(xiàn)E O'Donnell等研究在光老化致皮膚松弛膠原變性后可采用980 nm半導體激光治療光老化所導致的纖維組織病變[11]。有研究得出激光形成的生物光熱作用,造成膠原纖維面積增加[12]。有人在采用D980nm激光照射的動物研究中，結果表明I型膠原纖維含量實驗組顯著高于對照組[13]。成纖維細胞(fibroblast)是疏松結締組織中數(shù)目最多、最多見的細胞成分，可劃分為成纖維細胞和纖維細胞，它對不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損修復有著非常重要的作用。組織熱損傷可刺激功能停止的纖維細胞活化為活躍的成纖維細胞，發(fā)動組織修復機制。我們的研究顯示，SD大鼠皮膚受D980nm波長激光皮下照射后，實驗組與自身對照組相比，可明顯觀察到成纖維細胞數(shù)量增加，膠原纖維含量增加明顯，形態(tài)上增粗，纖維排列緊密，走向與表皮平行分布，并且更加整齊有規(guī)則。由上述激光照射后皮膚結構變化中發(fā)現(xiàn)，提示激光可能刺激停止的纖維細胞活化為活躍的成纖維細胞，促使大量成纖維細胞增殖，并且合成了許多膠原蛋白，且其效果與治療頻次有關。

相關實驗研究表明TGFβ1可促進成纖維細胞活化增殖，并能刺激成纖維細胞產(chǎn)生膠原蛋白等基質，抑制蛋白酶和基質酶活性，從而使細胞外基質沉積[9]。激光的高熱效應可促進真皮膠原新生，當激光照射時，皮膚組織中的水、脂肪、血紅蛋白等靶物質吸收光轉化成熱能，皮膚溫度增高，產(chǎn)生損傷發(fā)動創(chuàng)傷修復響應，釋放TGFβ1等細胞因子(cytokine，CK)，并刺激成纖維細胞活化增殖合成了新膠原。在炎癥反應中，對修復免疫系統(tǒng)的整體調節(jié)上，TGFβ1還發(fā)揮了很重要的作用[14]。較常見與創(chuàng)傷修復有關的CK為轉化生長因子β (TGFβ1)，并且它是促進成纖維細胞增殖分裂的重要CK。我們的研究表明在細胞因子方面，大鼠皮膚組織中TGFβ1在經(jīng)過D980nm激光進行皮下照射治療后表達增強，并且治療前后有顯著性差異(P<0.01)。其中III組實驗組明顯高于其余實驗組，并且具有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.01)，提示TGFβ1表達強弱與激光治療頻次有關。由此表明，SD大鼠皮膚受D980nm波長激光皮下照射后能使皮膚膠原纖維含量、成纖維細胞數(shù)量增加，TGFβ1表達增強，并且增加及表達量與激光照射頻次密切有關，其中3次照射組，大鼠皮膚膠原纖維含量、成纖維細胞數(shù)量增加，TGFβ1表達增強顯著，定量分析與各組比較，有顯著性差異(P<0.01)。這個結果也表明激光治療頻次是影響D980nm波長激光嫩膚效果的一個重要因素，不同的激光治療頻次可以產(chǎn)生不同的機制反應，因此使用合適的激光治療頻次來提高激光作用效果是非常有必要的，并且為后續(xù)的研究和臨床應用提供實驗依據(jù)和線索。

但是由于激光緊膚產(chǎn)生機制復雜，有多種細胞、多種信號通路參與，有諸多因素介入影響，不能研究透徹反應機制，只能部分闡明幾個重要影響因素。并且因為研究經(jīng)費以及時間上的限制，對于治療頻次的最優(yōu)頻次，如何達到激光各種治療參數(shù)的最優(yōu)化，包括波長、能量、脈寬、脈寬頻率、治療間隔時間等，以及如何更好契合激光與其它溶脂緊膚治療技術的應用，這些問題，有待下一步的研究。

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佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新項目，編號：YM2016 - 080。

黃信隆(1988 ～)男，浙江溫州人，在讀碩士研究生。

張威(1963 ～)男，黑龍江哈爾濱人，博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師。E - mail:kinwai01@163.com。

R454.2

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1008-0104(2017)04-0074-03

2016-12-04)