山茱萸多糖對局灶性腦缺血-再灌注損傷神經膠質細胞的作用①

鄧文偉，楊廣祿，鄧 萌，王淑英

(1. 佳木斯大學口腔醫學院，黑龍江 佳木斯 154002；2. 佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

山茱萸多糖對局灶性腦缺血-再灌注損傷神經膠質細胞的作用①

鄧文偉1，楊廣祿1，鄧 萌1，王淑英2

(1. 佳木斯大學口腔醫學院，黑龍江 佳木斯 154002；2. 佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的:研究山茱萸多糖對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的作用。方法：大鼠隨機分為A組(假手術組)，B組(缺血-再灌注組)，C組(山茱萸多糖干預組)，每組25只。制作大鼠局灶性腦缺血模型，免疫組化法測定GFAP、S-100蛋白、MBP的表達。結果：腦缺血-再灌注，B組星形膠質細胞(AS)GFAP表達增強；小膠質細胞S-100蛋白表達增強；少突膠質細胞MBP表達減少。C組較B組GFAP表達減弱；S-100蛋白表達減少；MBP表達增強。結論：山茱萸多糖可抑制AS反應性增生、可抑制小膠質細胞激活、抑制少突膠質細胞損傷。

山茱萸多糖;局灶性腦缺血-再灌注;神經膠質細胞

國內外學者對山茱萸的各種化學成分、藥理作用已有較系統的研究，其制劑廣泛用于治療心腦血管等疾病。許多實驗表明神經細胞在腦缺血-再灌注中易受到損傷，且山茱萸多糖對神經細胞具有保護作用[1，2]，但其對神經膠質細胞的作用研究較少。在腦組織中，神經膠質細胞對缺血缺氧較敏感，在缺血-再灌注中也易發生損傷。本實驗研究山茱萸多糖對腦缺血-再灌注損傷后大鼠神經膠質細胞的影響，以期在臨床治療過程中為山茱萸多糖的應用提供有一些更有價值的線索。

1 材料與方法

1.1 動物

Wistar成年大鼠， 280～350g，隨機被分為對照組(A組)：不栓塞，只分離大腦中動脈；缺血-再灌注組(B組)，大腦中動脈栓塞2h，24h后進行再灌注；山茱萸多糖治療組(C組)：大腦中動脈栓塞2h，栓塞后2min內注射山茱萸多糖于尾靜脈(20mg/kg)，24h再灌注，其間給藥3次。每組25只大鼠。手術前大鼠禁食12h，自由飲水。

1.2 模型制備

頸內動脈插線法造模[3～5]。3.5%水合氯醛麻醉大鼠(350mg/kg)。將其仰臥、固定，將頸部正中皮膚切開，分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，分離過程中注意不要刺激迷走神經。由頸總動脈的分叉處向頭端依次分離，將頸外動脈所有分枝燒斷，使主干游離。分離頸內動脈至顱底，分離翼腭動脈顱外段。用蛙心夾夾住頸總動脈和頸內動脈， 將手術縫合線放置在頸外動脈根部，在頸外動脈上剪一小口，位置靠近頸總動脈分叉處，沿切口插入蘸有肝素鈉溶液栓子入頸外動脈，為防止出血和栓子滑出，縛緊手術縫合線，松開蛙心夾，沿入顱方向緩慢地將栓子推進頸內動脈，長度大約19～21mm，稍有阻力即停。此時，栓子頭端停留在大腦中動脈與大腦前動脈分叉處。栓子固定好，即一側大腦中動脈的栓塞完成。栓塞后2h，進行大腦中動脈再灌注：即將栓子頭端輕拉到頸外動脈內，開始再灌注。

1.3 山茱萸多糖治療

手術后2min內向尾靜脈注射山茱萸多糖(20mg/kg)，每日3次。

1.4 神經病學評分

按照神經缺陷三級評分的標準[6]，符合三級評分標準的大鼠才能進行下一步試驗。

1.5 神經膠質細胞檢測

1.5.1 GFAP蛋白表達檢測

(1)用Poly-lysine將載玻片處理;(2)用低溫恒冷切片機切20μm厚連續切片，切片撈在經處理過的載玻片上；(3)純丙酮室溫條件下固定30min。蒸餾水沖洗、干燥、冰凍保存；(4)用加H2O2純甲醇(0.3%)室溫30 min浸泡，滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗3次。(5)于室溫滴加正常山羊血清封閉液，20min后多余液體去除；(6)滴加稀釋的一抗GFAP(1：100)，4℃過夜。0.1M PBS沖洗，每次2min，共計3次；(7)滴加IgG(山羊抗小鼠)，37℃ 20min。0.1M PB沖洗，每次2min，共計3次；(8)滴加HIGH-SABC，37℃ 20min，0.1M PBS沖洗，每次5min，共計4次；(9)DAB顯色;(10)輕度蘇木素復染。脫水、透明、封片。鏡下觀察。

1.5.2 S-100蛋白表達檢測

滴加的一抗為S-100，其他方法同上。

1.5.3 MBP蛋白表達檢測

滴加的一抗為MBP，其他方法同上。

1.6 統計學方法

2 結果

大鼠GFAP、S-100、MBP的表達，見表1。

表1 大鼠GFAP、S-100、MBP陽性表達 細胞數(個/400×視野，

給藥組與假手術組相比P﹤0.05；與模型組相比P﹤0.05。

3 討論

實驗結果顯示AS在腦缺血-再灌注損傷發生的反應表現為AS反應性增生，GFAP含量增高。當CNS損傷時，通過AS上的相應受體神經細胞釋放的細胞因子可刺激其分裂、增生，AS在其中某些因子的刺激下能產生和釋放細胞因子。這些因子反過來又提高它們的增殖[7]。AS對損傷發生的早期反應為AS自分泌的GFAP，是促進AS增生的主要細胞因子。在損傷區附近GFAP免疫活性明顯增加。山茱萸多糖干預組AS損傷較缺血-再灌注組明顯減輕(P﹤0.05)，其可能機制是山茱萸多糖能夠抑制GFAP蛋白的表達，減輕AS的增生。實驗中山茱萸多糖干預組小膠質細胞增生減輕，S-100蛋白表達減少。小膠質細胞具有鉀離子內外流動方式[9]，對胞外鉀離子濃度的變化非常敏感，因此，腦缺血后小膠質細胞興奮過度、細胞內外鉀離子濃度的變化可能是小膠質細胞活化的主要原因，山茱萸多糖可能是通過控制鉀離子的濃度從而起到保護作用。研究結果顯示腦缺血-再灌注損傷后少突膠質細胞MBP表達減少。這可能是少突膠質細胞比其他膠質細胞對缺血缺氧性損傷更為敏感的原因所致。少突膠質細胞胞體與星形膠質細胞和神經細胞相比，含鐵和鐵結合蛋白較豐富，谷胱甘肽含量較低，在自由基連鎖反應過程中鐵是催化劑，在細胞內還原型谷胱甘肽能清除自由基，是天然的清道夫。再灌注應激反應后細胞代謝過程明顯依賴氧化磷酸化，缺血缺氧的少突膠質細胞在這種代謝中最易發生應激性損傷[9]。山茱萸多糖干預組少突膠質細胞MBP陽性表達較正常組少，比缺血-再灌注組多。原因可能是山茱萸多糖能清除自由基，這樣由膜脂質過氧化引起的細胞外Ca2+內流就可受到抑制，由Ca2+濃度升高造成的各種損害就會減少，從而使少突膠質細胞的損害減輕，對少突膠質細胞起到保護作用。

[1]范慧晗,劉泰佐,毛金軍,等. 山茱萸多糖對AD大鼠c-fos和早老素-1表達的影響[J].中國老年學雜志,2015,35(13):3513-3516

[2]姚海濤，馬金麗，張曉波,等.山茱萸多糖對阿爾茨海默病模型大鼠tau蛋白的影響[J].中國老年學雜志, 2013,33(12):2838-2841

[3]Nagasawa H,Kogure K. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion [J]. Stroke, 1989,20:1037-1043

[4]汪家龍,劉才棟.實驗性急性腦缺血模型及其研究進展[J].解剖科學進展，1999， l5(3):212-214

[5]馬常升,馬文領.插線法制備大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型的研究[J].解剖學雜志，1999,22(3): 209-213

[6]Kuluz JW,Prado RJ,Dietrich D,et al.The effect of nitric oxide synthase inhibition on infarct volume after reversible focal ischemia in conscious rats[J].Stroke,1993,24:2023

[7]鄭觀成主編.腦老化與老年癡呆.老年癡呆與系統工程[M].上海:上海科學技術文獻出版社,1995

[8]Kettenmann H,Hoppe D,GottmannK,et al.Cluturedmicroglial cells have a distinct pattern of membrane channels different from peritoneal macrophager[J].J Neuroxci Res,1990,26:278-287

[9]Juurlink BH. Response of glial cells to ischemia: roles of reactive oxygen species and glutathione[J]. Neurosci Biobehav Rev, 1997,21(2):151-166

1.黑龍江省衛生廳科研項目，編號：2014-256；2.黑龍江省中醫藥管理局項目，編號：ZHY16-018。

鄧文偉(1963～)男，黑龍江佳木斯人，學士，教授，碩士研究生導師。

王淑英(1974～)女，黑龍江佳木斯人，博士，副教授。E-mail:lycwsy3742@163.com。

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