粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子轉染對白血病細胞K562形態及增殖的影響

陳蓉，常晉霞，李雪璐，彭麗娟，朱紅

(川北醫學院醫學微生物學與免疫學教研室，四川南充 637000)

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子轉染對白血病細胞K562形態及增殖的影響

陳蓉，常晉霞，李雪璐，彭麗娟，朱紅

(川北醫學院醫學微生物學與免疫學教研室，四川南充 637000)

目的 觀察重組PcDNA3.1-粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、外源性GM-CSF對髓系白血病細胞(K562)形態及增殖的影響。方法 將K562細胞分為4組，重組質粒組、外源性組、空質粒組細胞分別以重組PcDNA3.1-GM-CSF、外源性GM-CSF、PcDNA3.1空質粒轉染，細胞對照組細胞未轉染任何質粒，觀察各組細胞形態學變化及細胞增殖情況。結果 光學顯微鏡下，細胞對照組、空質粒組及外源性組細胞形態相似，細胞著色呈深藍色，細胞質和細胞核不易區分；重組質粒組細胞形態和其余3組明顯不同，細胞質呈淺藍色，細胞核呈淡粉紅色，分界清楚，部分細胞內可見腎形、馬蹄形細胞核。顯微鏡油鏡下，細胞對照組、外源性組及空質粒組結果相似，細胞著色深，呈深藍色，細胞內未見任何顆粒沉積；重組質粒組部分細胞著色呈深藍色，部分細胞著色呈淺粉色，呈淺粉色的部分細胞內可見有斑點狀甲臜顆粒沉積。與其余2組比較，重組質粒組第3、5、7、9天細胞增殖抑制率升高(P均<0.05)；與空質粒組比較，外源性組第3、5、7天細胞增殖抑制率升高(P均<0.05)。結論 重組PcDNA3.1-GM-CSF及外源性GM-CSF均能使K562細胞形態發生改變、增殖受到抑制，作用強度隨作用時間延長而增加，且重組PcDNA3.1-GM-CSF抑制作用強于外源性GM-CSF。

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；白血病細胞；細胞形態；細胞增殖

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種能調節造血祖細胞增殖、分化的細胞因子[1]，亦可刺激巨噬系、紅系、嗜酸系、粒系等多系造血細胞的前體細胞增殖和分化[2]。GM-CSF的生物學作用較為廣泛，能增加巨噬細胞和單核細胞抗體依賴細胞介導細胞毒性作用，可調整機體免疫細胞對腫瘤細胞的攻擊殺傷能力，具有抗腫瘤的作用[3]。研究[4～6]表明，GM-CSF在輔助治療惡性腫瘤方面有其不可替代的作用。因GM-CSF在抗瘤治療方面的優越性，使其受到基礎研究者及臨床工作者的廣泛關注。本研究應用外源性GM-CSF及已構建的PcDNA3.1-GM-CSF真核表達質粒[7]轉染髓系白血病細胞(K562)，觀察兩者對細胞形態及增殖的影響，旨在為進一步探索GM-CSF治療白血病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 質粒及主要試劑 重組質粒PcDNA3.1-GM-CSF(本研究團隊自己構建)；脂質體轉染試劑(天根生化科技有限公司)；K562細胞(NTCC典型培養物保藏中心-BioVector質粒載體菌種細胞基因保藏中心)；人源性GM-CSF(美國派普泰克公司，用1640培養液配制，過濾除菌后-20 ℃保存)；1640培養基、新生牛血清(塞默飛世爾科技公司)；NBT染液(NBT 0.28 g加入生理鹽水100 mL，濾器過濾，4 ℃保存)；NBT培養液(正常人血清0.5 mL加入生理鹽水0.3 mL和NBT染液0.6 mL)。

1.2 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子轉染對K562細胞形態的影響觀察 ① 光學顯微鏡下觀察：常規復蘇K562細胞，待細胞生長良好，用1640培養液配制K562細胞懸液，將K562細胞接種于24孔板中，每孔細胞數約5×104個。于細胞培養箱37 ℃、5%CO2環境下培養24 h，離心，去上清。將培養細胞分為4組，每組六孔。細胞對照組：只有K562細胞和細胞培養液，即只在該組細胞培養孔中加入含20%新生牛血清1640培養液500 μL，培養72 h。空質粒組：先配置脂質體-空質粒混合物(將2 μL脂質體轉染試劑加入48 μL無血清無抗生素的1640培養液中)，混勻，室溫放置5 min，同時將2 μL的空質粒(0.5 μg/μL)和48 μL無血清無抗生素的1640培養液混勻，再將上述兩種液體放在一起混勻，室溫放置20 min。在每孔細胞培養孔中先加入400 μL的無血清的1640培養液，然后將脂質體-空質粒混合物逐滴加入孔中，每孔100 μL，輕輕搖動，使其均勻分布(方法來源于脂質體轉染試劑盒使用說明)，37 ℃、5%CO2環境下培養6 h后，離心，去上清，每孔加入500 μL含20%新生牛血清的1640培養液，在細胞培養箱中(37 ℃、5%CO2)培養72 h。重組質粒組：具體操作方法及質粒濃度同空質粒組，只是將轉染的空質粒換成了重組質粒。外源性組：先在每孔細胞培養孔中加入含20%新生牛血清1640培養液400 μL，再在每孔中加入外源性GM-CSF 100 μL(800 ng/mL)，輕輕搖動，混勻，在細胞培養箱中(37 ℃、5%CO2)培養72 h。分別收集各組培養細胞，離心，取沉淀細胞涂片于載玻片上，自然干燥，Wright-Giemsa染色，水洗，干后低、高倍鏡鏡檢，觀察各組細胞染色情況、形態及細胞核的變化，攝片保存。該實驗重復3次。②顯微鏡油鏡下觀察：采用硝基四氮唑藍還原試驗(NBT還原試驗)。常規復蘇K562細胞，待細胞生長良好，用1640培養液配制K562細胞懸液，將K562細胞接種于24孔板中，每孔細胞數約5×104個。于細胞培養箱37 ℃、5%CO2培養24 h，離心，去上清。將培養細胞分為4組，每組六孔，分組及各組細胞處理方法同①。在細胞培養箱中37 ℃、5%CO2培養72 h。72 h后，分別收集各組細胞，離心，棄上清，取細胞沉淀0.1 mL和NBT培養液0.1 mL加入凹玻片孔中混勻，置濕盒37 ℃、20 min，置室溫15 min，中間振動1次。取1滴混懸液于防脫載玻片一端推成薄片，空氣中快速干燥。甲醇固定1 min，Wright-Giemsa染色，水洗，干后油鏡鏡檢，觀察細胞內是否有異常顆粒，攝片保存。該實驗重復3次。

1.3 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子轉染對K562細胞增殖的影響觀察 按1.2方法采用脂質體轉染試劑轉染質粒方式，分別轉染PcDNA3.1空質粒于K562細胞及重組質粒PcDNA3.1-GM-CSF于K562細胞，37 ℃、5%CO2培養72 h后，離心，去上清備用。用1640培養液分別配制K562細胞懸液(分3種細胞配制：K562細胞、轉染PcDNA3.1空質粒細胞、轉染重組質粒PcDNA3.1-GM-CSF細胞)。實驗分組如下：①細胞對照組：單純K562細胞；②空質粒組：細胞轉染PcDNA3.1空質粒；③重組質粒組：細胞轉染重組質粒PcDNA3.1-GM-CSF；④外源性組：細胞轉染外源性GM-CSF。將上述細胞懸液按上述分組分別接種于96孔板中，使每孔含5×104個細胞，每組設3個平行孔。用細胞培養液將每孔終體積補足為200 μL，置37 ℃、5%CO2培養箱中培養72 h，離心，棄上清，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL和1640培養液180 μL，37 ℃繼續孵育4 h終止培養。離心，棄去培養上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速震搖10 min，酶標儀測定570 nm吸光度OD值。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。觀察第3、5、7、9天細胞增殖抑制率。實驗重復3次。

2 結果

2.1 K562細胞形態學變化 光學顯微鏡下，細胞對照組、空質粒組及外源性組的形態相似，細胞著色呈深藍色，細胞質和細胞核不易區分(圖1A)；重組質粒組細胞形態和細胞對照組、外源性組細胞明顯不同，細胞質呈淺藍色，細胞核呈淡粉紅色，分界清楚，部分細胞內可見腎形、馬蹄形細胞核(圖1B)。顯微鏡油鏡下可見，對照組、外源性組組及空質粒組結果相似，細胞著色深，呈深藍色，細胞內未見任何顆粒沉積(圖2A)；重組質粒組鏡下可見部分細胞著色呈深藍色，部分細胞著色呈淺粉色，呈淺粉色的部分細胞內可見有斑點狀甲臜顆粒沉積(圖2B)。

注：A為細胞對照組，B為重組質粒組。

圖1 光學顯微鏡下細胞形態學變化

注：A為細胞對照組，B為重組質粒組。

圖2 顯微鏡油鏡下細胞形態學變化(×1 000)

2.2 K562細胞增殖抑制率比較 結果見表1。

表1 各組不同時點細胞增殖抑制率比較

注：與空質粒組比較，△P<0.05；與外源性組比較，﹟P<0.05。

3 討論

白血病是一類好發于青少年的惡性腫瘤，是造血干細胞惡性克隆性疾病，患者可出現不同程度的貧血、出血、感染及肝、脾、淋巴結腫大和骨骼疼痛。據文獻報道，我國各地區白血病發病率在各種腫瘤中居第6位。目前，白血病的臨床治療以化療、放療、靶向治療、免疫治療、干細胞移植等為主。免疫療法可特異性殺傷腫瘤細胞，對正常細胞危害較小，或有望成為治療惡性腫瘤包括白血病的重要方法。研究[8]發現，白血病患者外周血、淋巴結、脾臟、骨髓中可檢測到抑制正常造血干細胞增殖的惡性克隆B細胞。白血病患者的T細胞通過抗原提呈細胞上調免疫反應，降低免疫突觸的形成[9]。因此，白血病的治療或可從裂解白血病患者惡性克隆的細胞入手，如抗CD20單克隆抗體通過激活補體系統，形成攻膜復合物，從而裂解白血病患者惡性克隆的B細胞，或以集落刺激因子來刺激惡性克隆的細胞，以達到治療效果[10]。K562細胞為人類髓性白血病人工培養的第一個細胞，同時也具有多向分化潛能，因此被廣泛用于研究腫瘤如白血病的治療、藥物靶標等領域中。

已有研究[11,12]證實，GM-CSF不僅可作用于骨髓造血細胞分化的較早階段，同時還可刺激多能干細胞及早期紅細胞的增殖、分化和促進成熟細胞向外周血釋放，從而提高機體抗腫瘤和抗感染免疫力。Stripecke等[13]發現，將B7.1基因和GM-CSF基因修飾的聯合瘤苗應用于白血病的治療，抑瘤率比單一基因更顯著。將GM-CSF注射到小鼠皮下，會增加白細胞的吞噬功能，還會促進巨噬細胞的成熟及影響巨噬細胞在組織中的數量[14]。GM-CSF作為細胞因子，能夠調節機體免疫細胞對腫瘤細胞的攻擊殺傷能力，具有抗腫瘤的作用[15]。目前，GM-CSF主要用于惡性腫瘤放化療后所致白細胞減少癥及某些免疫缺陷性疾病的造血、再生性障礙貧血和免疫功能重建等治療中[16]。GM-CSF對治療癌癥放化療、骨髓移植、艾滋病等各種原因引起的白細胞減少癥，提高患者抗感染能力亦有較好療效[17]。研究[18]發現，GM-CSF可通過調節糖蛋白或其自分泌產物，而保護粒細胞與巨噬細胞的功能免受白血病細胞攻擊，還可提高癌癥患者化療后白細胞水平。GM-CSF可刺激造血干細胞釋放入外周血，釋放入血的造血干細胞很大程度上取代了骨髓移植手術植入的造血干細胞，骨髓移植手術還易給癌癥患者造成醫源性骨髓移植損傷，故GM-CSF或將成為治療惡性腫瘤的新途徑。

本研究顯示，與細胞對照組及空質粒組比較，重組質粒組及外源性組第3、5、7天細胞增殖抑制率均降低(P均<0.05)；與外源性組比較，重組質粒組第3、5、7天細胞增殖抑制率均降低(P均<0.05)。提示重組PcDNA3.1-GM-CSF及外源性GM-CSF均能使K562細胞增殖受到抑制，作用強度隨作用時間延長而增加，且重組PcDNA3.1-GM-CSF抑制作用強于外源性GM-CSF。本研究還顯示，與外源性組、空質粒組、細胞對照組比較，重組質粒組第9天細胞增殖抑制率均降低(P均<0.05)；而外源性組與其余3組比較均無統計學差異。說明外源性GM-CSF對K562細胞的抑制作用隨著時間的延長出現衰減現象。綜上，重組PcDNA3.1-GM-CSF抑制作用強于外源性GM-CSF，而且使用內源性的重組PcDNA3.1-GM-CSF作用于腫瘤細胞，可以在一定程度上避免在使用外源性GM-CSF時可能出現的污染，也在一定程度上彌補了外源性GM-CSF作用時間短暫的缺陷，具有一定的優越性。本研究還發現，轉染重組質粒PcDNA3.1-GM-CSF后，部分K562細胞轉變成NBT陽性細胞，NBT陽性細胞具有一定吞噬功能。轉染PcDNA3.1-GM-CSF的K562細胞形態發生了明顯改變，部分細胞內出現腎形馬蹄形核，這與吞噬細胞的形態學特點有相似之處。如果將重組質粒PcDNA3.1-GM-CSF轉染到K562細胞內，能使K562細胞轉為具備吞噬白血病細胞功能的細胞，有望用其治愈白血病。

[1] Croxford AL, Spath S, Becher B. GM-CSF in neuroinflammation: licensing myeloid cells for tissue damage[J]. Trends Immunol, 2015,36(10):651-662.

[2] Waller EK. The roles of sargramostim (rhGM-CSF) as immunotherapy[J]. Oncologist, 2007,12(2):22-26.

[3] Weiskopf K, Weissman IL. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer[J]. Mabs, 2015,7(2):303-310.

[4] 楊旭偉,陳元仲,林振興,等.B7.1 GM-CSF基團修飾的EL-4細胞激發小鼠抗淋巴瘤免疫反應[J].細胞與分子免疫學雜志,2002,18(2):359-362.

[5] 王艷,李巖.大腸癌細胞因子基因治療的研究現狀[J].世界華人消化雜志,2004,12(6):1445-1450.

[6] Francisco-Cruz A, Mata-Espinosa D, Estrada-Parra S, et al. Immunotherapeutic effects of recombinant adenovirus encoding granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in experimental pulmonary tuberculosis[J]. Clin Exp Immunol, 2013,171(3):283-297.

[7] 朱紅,唐恩潔,楊曉紅.PcDNA3.1-GM-CSF重組質粒的構建及鑒定[J].川北醫學院學報,2010,25(2):106-108.

[8] Hallek M. Chronic lymphocytic leukemia: 2015 Update on diagnosis, risk stratification, and treatment[J]. Am J Hematol, 2015,90(5):446-460.

[9] Krackhardt AM, Harig S, Witzens M, et al. T-cell responses against chronic lymphocytic leukemia cells: implications for immunotherapy[J]. Blood, 2002,100(1):167-173.

[10] Grupp SA, Kalos M, Barrett D, et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia[J]. N Engl J Med, 2013,368(16):1509-1518.

[11] Jalili A. Dendritic cells and their role in cancer immunotherapy[J]. Iran J Immunol, 2007,4(3):127-144.

[12] Nanjappa SG, Hernández-Santos N, Galles K, et al. Intrinsic MyD88-Akt1-mTOR signaling coordinates disparate Tc17 and Tc1 responses during vaccine immunity against fungal pneumonia [J]. PLoS Pathogen, 2015,11(9):e1005161.

[13] Stripecke R, Cardoso AA, Pepper KA, et al. Lentiviral vectors for efficient delivery of CD80 and granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor in human acute lymphoblastic leukemia and acute myeloid leukemia cells to induce antileukemic immune responses[J]. Blood, 2000,96(4):1317-1326.

[14] Metcalf D. The colony-stimulating factors and cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2010,10(6):425-434.

[15] Basturk A, Akinci S, Hacibekiroglu T, et al. Prognostic significance of flow cytometry findings in Turkish adult acute leukemia patients[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2015,19(18):3360-3366.

[16] Cohen JB, Bucur S, Winton EF, et al. Combination of GM-CSF with fludarabine-containing regimens in chronic lymphocytic leukemia and indolent non-hodgkin lymphoma[J]. Clin Lymphoma Myeloma Leuk, 2015,15(9):514-518.

[17] Messmann JJ, Reisser T, Leith?user F, et al. In vitro-generated MDSCs prevent murine GVHD by inducing type 2 T cells without disabling antitumor cytotoxicity[J]. Blood, 2015,126(9):1138-1148.

[18] Peralta OA, Bucher D, Angulo C, et al. Tissue localization of GM-CSF receptor in bovine ovarian follicles and its role on glucose uptake by mural granulosa cells [J]. Anim Reprod Sci, 2016,170(7):157-169.

Effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor transfection on morphology and proliferation of leukemia cells K562

CHENRong,CHANGJinxia,LIXuelu,PENGLijuan,ZHUHong

(DepartmentofMicrobiologyandImmunologyofNorthernSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China)

Objective To observe the effects of exogenous granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and recombinant PcDNA3.1-GM-CSF on the morphology and proliferation of myeloid leukemia cells K562. Methods K562 cells were randomly divided into four groups. Recombinant PcDNA3.1- GM-CSF, exogenous GM-CSF, and PcDNA3.1 null plasmids were transfected into K562 cells as the recombinant plasmid group, the exogenous group and the empty plasmid group, respectively, and the non-transfected plasmid was set as the control group. The morphological changes of cells were observed under the optical microscope by using high power lens and oil lens, respectively, and the cell proliferation was measured by MTT. Results Morphological changes seen under high power lens: the control group, the empty plasmid group and exogenous group were similar in morphology, cells were stained dark blue, whereas no clear boundary was seen between the cytoplasm and nucleus; compared with these three groups, the cells of the recombinant plasmid group showed a significant difference, the cytoplasm was stained light blue, and the nuclei were pale pink along with a clear bounds between them. Kidney or horseshoe shaped nuclei could be seen in some of the cells. Morphological changes seen under oil lens: the control group, the exogenous group, and empty plasmid group were similar, the cells were stained dark blue, and granules deposition wasn't seen in the cells; as to the recombinant plasmid group, some cells were stained dark blue, while some were pale pink in which dotted formazan particles were seen. Results of cell proliferation assay: Compared with the other two groups, the inhibition rate of cell proliferation in the recombinant plasmid group showed an increase on the 3th , 5th, 7th and 9th days (P<0.05). Compared with the empty plasmid group, the inhibition rate in the exogeneous group displayed an increase on the 3th, 5th and 7th days (P<0.05). Conclusion Both recombinant PcDNA3.1-GM-CSF and exogenous GM-CSF could induce morphological change and lead to proliferation inhibition in K562 cells, the effects increase along with time, and the inhibitory effect of recombinant PcDNA3.1-GM-CSF is stronger than that of the exogenous GM-CSF.

granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; leukemic cells; cell morphology; cell proliferation

四川省教育廳自然科學基金資助項目(12ZB214)。

陳蓉(1982-)，女，碩士，講師，主要研究方向為醫學免疫學和微生物學。E-mail： chenr1232@163.com

朱紅(1975-)，女，碩士，副教授，主要研究方向為醫學免疫學和微生物學。E-mail： zhuhongyuxia@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.002

R730.5

A

1002-266X(2017)31-0005-04

2017-03-06)