大鼠腦梗死后交叉性小腦神經機能聯系不能的DTI評價

林亞南，程敬亮，張 勇，楊 璐，趙珊珊，張曉楠

（鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000）

大鼠腦梗死后交叉性小腦神經機能聯系不能的DTI評價

林亞南，程敬亮，張 勇，楊 璐，趙珊珊，張曉楠

（鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000）

目的：通過DTI檢測大鼠大腦中動脈閉塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）后梗死核心遠隔區域擴散參數的變化情況，并運用免疫組化檢測腦組織RGMa蛋白的表達。檢測腦梗死核心區域及雙側小腦半球的擴散情況及病理改變，進一步了解交叉性神經機能聯系不能（Crossed cerebellar diaschisis，CCD）的相關機制。方法：將所有動物隨機分為2組，實驗組56只，對照組14只。實驗組及對照組大鼠在模型制作成功后1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h和72 h分別行MRI動態觀察，并用免疫組化法檢測大鼠雙側小腦半球RGMa蛋白的表達。結果：實驗組大鼠MCAO后各時間點，磁共振成像結果示：雙側小腦半球與正常對照組相比，FA值均降低，12 h降至最低，對側（右側）小腦半球較同側（左側）小腦半球降低更明顯。免疫組化結果示：雙側小腦半球與正常對照組相比，RGMa蛋白表達均升高，至24 h達最高峰，對側小腦半球較同側小腦半球升高更明顯。結論：磁共振DTI技術結合RGMa蛋白病理學檢查可以發現幕上腦梗死后CCD現象，并可以解釋CCD發生的相關機制。

腦梗塞；大鼠；磁共振成像

腦梗死是最常見的腦血管病，具有高發病率、高致殘率和高致死率的特點。腦梗死不僅可以造成梗死核心區域的病理生理變化，也可引起遠隔區域的繼發性改變。其發生機制與神經機能聯系不能（Crossed cerebellar diaschisis，CCD）學說有關，是指幕上局灶性腦損傷可以造成與它有纖維聯系的遠隔區域短暫的功能改變。以往關于CCD的研究多采用正電子發射斷層成像 （Positron emission tomography，PET）和單光子發射計算機斷層成像 （Singlephoton emission computed tomography，SPECT） 技術。但是以上兩種技術檢查費用昂貴，而且具有輻射，因此探索新的磁共振技術來研究CCD現象就非常重要。

本研究采用磁共振彌散張量成像（Diffusion tensor imaging，DTI）對大鼠大腦中動脈閉塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）后不同時間點不同部位腦組織的表觀擴散系數及部分各向異性分數情況進行檢測，并運用免疫組織化學檢測與磁共振檢查相應時間點、相應部位腦組織的RGMa蛋白的表達。以此來檢測腦梗死核心區域及雙側小腦半球的擴散情況及病理改變，進一步了解CCD的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要儀器、試劑

成年健康雄性清潔級SD大鼠，體質量270～320g。Signa HDxt 3.0T 磁共振掃描儀（GE 公司，德國），大鼠多通道線圈（辰光醫療器械有限公司，上海，型號CG－MUC22－H300－AG，孔徑 5 cm×5 cm），病理圖文分析系統（千屏影像工程公司，武漢），兔抗RGMa特異性抗體（Abcam公司，美國），RGMa蛋白免疫組化試劑盒（中杉生物技術有限公司，北京）。

1.2 大鼠腦梗死模型的建立及實驗動物分組

將所有動物按照隨機數字表法隨機分為2組。實驗組 （MCAO 組）：56 只，10%水合氯醛 （0.3mL/100 g體質量），采取腹腔注射進行麻醉，參照改良的Longa法建立大鼠左側MCAO模型。參照Longa等[1]確立的評分方法進行評分，標準為：0分，無任何神經損傷癥狀；1分，對側前肢不能完全伸展；2分，行走時向對側繞圈；3分，站立時向對側傾倒；4分，不能獨立行走，喪失意志。出現以上表現，評分達2～3分的大鼠視為造模成功，并納入實驗組。假手術組不產生以上任何類似表現。對照組（假手術組）：14只，僅暴露左側大腦中動脈，不插入線栓，余操作同實驗組。術后單籠飼養，注意保溫，密切觀察動物的行為變化及生命體征。實驗組及對照組大鼠在模型制作成功后 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h 和 72 h 分別行MRI動態觀察，各實驗點大鼠8只。

1.3 磁共振檢查及后處理

實驗組及對照組大鼠分別行橫軸位T1加權成像和T2加權成像、矢狀位T2加權成像、DWI、DTI序列掃描。掃描參數如下：快速自旋回波FSE序列T1WI，TR/TE=360ms/23.3ms， FOV=70mm×70mm，NEX=4.00，矩陣 320×256；快速自旋回波 FSE 序列T2WI，TR/TE=2 300ms/115.3ms，FOV=70mm×70mm，NEX=4.00，矩陣 256×256；單次激發的 SE/EPI序列DWI，TR/TE=2350ms/78.9ms，FOV=110mm×110mm，NEX=4.00，矩陣 96×96；DTI：TR/TE=2 500ms/92.2ms，FOV=110mm×110mm，NEX=4.00， 矩陣 128×128，b值=500 s/mm2，方向數為 16。

1.4 磁共振圖像后處理

應用美國GE公司提供的后處理工作站進行圖像的后處理及一系列數據統計。圖像后處理技術：DTI， 圖像傳輸至 Functool 5.4.07軟件進行后處理，進入DTI處理界面。調閾值（所有腦實質被綠色斜線覆蓋）→點擊計算獲得ADC圖和FA圖，將獲得的圖像批量保存，在梗死核心和雙側小腦半球設置感興趣區 （Regions of interest，ROI）， 在 ADC 圖和FA圖上進行測量，記錄數據，每個部位均重復測量3次取平均值。

1.5 免疫組化法檢測大鼠雙側小腦半球RGMa蛋白的表達

MCAO 組大鼠按照相應時間點（1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、72 h）掃描后，每個時間點各取2只大鼠進行標本制作。過量麻醉大鼠后，用持針器開胸，鈍性分離并暴露出心臟，用注射器抽取0.3mL的2.5%肝素鈉注入左心室，剪去右心耳，于左心室灌注約200mL的9%生理鹽水直至澄清，以排除腦血管內血液的干擾，斷頭取腦，用4%的多聚甲醛液固定備用。

大鼠腦組織切片常規脫蠟后，滴加3%的H2O2適溫孵育5～10min，蒸餾水沖洗3次。滴加兔血清封閉液（5%），保持室溫20min，甩去多余的液體。隨后滴加1∶100的兔抗RGMa抗體，4℃孵育過夜。生物素標記的山羊抗兔IgG，保持37℃孵育30min。辣根酶標記的鏈霉卵白素，37℃中孵育30min，然后用PBS溶液沖洗。DAB顯色后蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下照相進行定量分析，具體如下：每個組織塊連續切片3張，每張切片隨機選取5個視野，高倍鏡下（400×）觀察分析并采集圖像。以Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics公司）軟件獲取整合光密度（Integrated optical density，IOD）和面積（單位為像素）值。 本實驗規定平均光密度=IOD/面積×1 000，作為目的蛋白表達定量比較的指標。

實驗流程圖如下：

2 結果

2.1 MCAO大鼠雙側小腦半球腦組織的FA值及ADC值結果

本研究制作的MCAO模型的成功率為50%，失敗原因包括模型制作過程中大鼠失血過多而死亡、模型制作后動態觀察中死亡及模型制作后行MRI檢查發現未出現基底節區梗死等。基底節區梗死面積由點狀至大片狀不等。大鼠MCAO后每個時間點，雙側小腦半球與正常對照組相比，FA值均降低，12 h降至最低，對側（右側）小腦半球較同側（左側）小腦半球降低更明顯，見表1及圖1。大鼠MCAO后每個時間點，雙側小腦半球與正常對照組相比，ADC值均降低，12 h降至最低，后有所回升，但仍低于對照組；梗死對側小腦半球較梗死同側小腦半球降低更明顯，見表2。

2.2 MCAO大鼠雙側小腦半球腦組織RGMa蛋白的表達

大鼠MCAO后每個時間點，雙側小腦半球與正常對照組相比，RGMa蛋白表達均升高，24 h達最高峰，對側（右側）小腦半球較同側（左側）小腦半球升高更明顯，見表3及圖2。

2.3 磁共振FA值及ADC值的變化與RGMa蛋白表達的相關性

本研究結果顯示：大鼠MCAO后雙側小腦半球FA值的變化與RGMa蛋白表達的變化顯著負相關（Spearman 相關性檢驗， 相關系數 r=－0.341，P＜0.05）。大鼠MCAO后雙側小腦半球ADC值的變化與RGMa蛋白表達的變化顯著負相關（Spearman相關性檢驗，相關系數 r=－0.341，P＜0.05）。

表1 正常對照組及MCAO后不同時間點FA值變化

表2 對照組及MCAO后不同時間點ADC值變化（單位:×10－4/mm2）

表3 正常對照組及MCAO后不同時間點RGMa值變化（單位：OD/μm2）

3 討論

本研究通過DTI檢測大鼠MCAO后梗死核心遠隔區域的擴散參數的變化情況。磁共振DTI評價幕上腦梗死后遠隔區域的變化，國內外鮮有此類文獻報道。DTI是基于擴散加權成像基礎上發展起來的一項無創性觀察體內水分子擴散運動的新技術[2－5]，我們可以利用此檢查手段來檢測腦梗死后遠隔區域（小腦）的擴散情況的變化。并與病理學指標軸突生長抑制因子RGMa相結合，來探討幕上腦梗死后交叉性小腦CCD的相關機制。

3.1 DTI對大鼠MCAO后交叉性小腦CCD的分析

以往大多數國內外學者多采用DTI技術來評價急性期腦梗死核心區域的擴散參數的變化，而對于幕上腦梗死后遠隔區域（丘腦、橋腦及小腦）的信號變化的研究卻極少。本研究通過改良的Longa法建立大鼠MCAO模型后發現，梗死核心區域和雙側小腦半球的FA值及ADC值在腦梗死后1 h開始降低，12 h達到最低，然后有所回升，但仍低于正常對照組，并沒有達到假性正常化，分析此原因可能是因為本實驗采用的是改良的MCAO模型，梗死較為徹底。本實驗結果證實梗死區域遠隔部位即小腦的擴散參數隨梗死核心區變化而變化。出現此現象的原因可能為超急性期幕上梗死后，大腦微循環灌注量降低，當跌落至膜衰竭閾值時，就會導致神經細胞的細胞膜Na+-K+泵功能受損，細胞外的水分子進入細胞內導致細胞毒性水腫，因此，細胞內水分子擴散受限，FA值及ADC值降低，然后將啟動神經細胞死亡。此時，由大腦皮層發出的神經信號的傳輸就會或多或少的受到影響，雙側大腦間通過縱橫交錯的神經纖維相聯系，受控制的遠隔區域就會發生功能受限。本研究中，雙側小腦的FA值及ADC值的變化均與正常對照組存在統計學差異，說明本研究MCAO模型的幕上梗塞腦組織影響到連接雙側大腦半球的胼胝體聯合纖維及CPC通路信號的正常傳導，使梗死遠隔部位發生功能受限。而神經活動的變化，會造成其偶聯的相應部位血流量發生相應的改變[6]，組織內的ADC值反映水分子擴散及毛細血管灌流[7]，故幕上腦梗死后就出現了遠隔部位ADC值的差異。FA值反映組織內水分子擴散的程度和方向，FA值的降低反映了相應區域腦組織內神經纖維束的排列失去了方向性和一致性，因此遠隔部位FA值的降低可能提示了神經傳導通路的障礙，特別是與CCD相關的皮質-橋-小腦通路的損傷[8]。

圖1a～1h 分別為正常對照組大鼠以及MCAO后大鼠雙側小腦半球1 h、3h、6 h、9 h、12 h、24 h及72 h彩色FA圖，隨著梗死時間的延長，MCAO大鼠雙側小腦半球FA值逐漸降低，且以右側小腦半球明顯。 圖2a～2d 分別為正常對照組大鼠以及MCAO后大鼠右側小腦半球1 h、24 h及72 h免疫組化RGMa蛋白的表達，隨著梗死時間的延長，陽性區積分光密度值逐漸增加。Figure 1a～1h.Color FA maps of normal control group rats and rats after MCAO at 1 h,3 h,6 h,9 h,12 h,24 h and 72 h.With the prolongation of infarct time,the bilateral cerebellar hemispheres FA value of MCAO rats was gradually decreased,and the right cerebellar hemisphere was significantly decreased. Figure 2a～2d. RGMa expression(immunohistochemi-cal staining)of normal control group rats and rats after MCAO at 1 h,24 h and 72 h.With the prolongation of infarct time,the integral light density of positive area increased gradually.

本研究中，雙側小腦半球的FA值及ADC值均隨梗塞核心區域的變化而變化，提示幕上腦梗死后CCD的存在，而且大腦梗死對側小腦半球較腦梗死同側小腦半球FA值和ADC值變化幅度大，兩者相比具有統計學意義。出現這種現象的原因可能是因為大腦皮層多數的神經纖維交叉到對側小腦，而很少一小部分則傳導至同側小腦，因此左側大腦半球梗死后，影響較重的則是右側小腦半球，而不是左側小腦半球。

3.2 RGMa評價幕上腦梗死后CCD的發生

幕上腦梗死造成機體神經功能的缺損，這不僅與梗死灶局部損傷后神經細胞的凋亡和壞死有關，而且也與梗死灶遠隔區域的相關部位的繼發性神經細胞的凋亡和壞死有關。細胞凋亡和壞死發生的嚴重程度和速度受許多因素的影響，有研究提示與神經生長抑制因子、神經營養障礙、腦局部血流減少、蛋白合成抑制以及神經遞質調節失衡等因素有關。其中，神經生長抑制因子的作用被認為是最重要的影響因素。近幾年的研究發現，RGMa是一種新的具有抑制軸突生長作用的神經生長抑制因子，它主要介導神經管閉合及排斥性軸突導向信號，并控制著神經元的生長、增殖及分化。其可以存在于正常大鼠的脈絡叢、小腦浦肯野纖維、血管周圍及腦干神經元中。Schwab等[9]研究成年哺乳動物脊髓和腦外傷中發現在中樞神經系統損傷后，RGMa出現在軸突生長抑制物中，再用微量泵對其給予抗RGMa抗體進行干預后，結果則有利于神經功能的康復，因此推測RGMa參與了中樞神經系統損傷后的軸突生長抑制作用，抗RGMa抗體則可以通過中和RGMa蛋白來顯著促進軸突的生長及受損神經纖維的再生。而Brinks等[10]的研究表明，給予海馬CAI區皮層特異性RGMa抗體后，則軸突生長出現混亂，不能到達正確的靶區，因此，RGMa的過高及過低表達均不利于軸突的生長發育。RGMa對神經軸突生長的抑制作用在體內外實驗已經被證實[11]，但是以往的在體研究主要局限于脊髓損傷，在腦缺血中關于RGMa的作用研究較少。我們的研究發現，在大鼠腦梗死后1 h就有RGMa蛋白表達的升高，至24 h達到高峰，72 h時稍有下降，但仍高于正常腦組織RGMa蛋白的表達。這表明幕上梗死核心區及梗死遠隔部位即小腦RGMa蛋白表達的升高與缺血區軸突數量減小密切相關。在急性腦缺血早期，RGMa蛋白的過度表達不利于軸突與樹突之間形成正確的神經環路，抑制神經纖維的再生，阻礙了神經功能的康復。RGMa蛋白主要通過破壞神經纖維的髓鞘化來抑制軸突的生長，而神經纖維髓鞘化的破壞會導致腦組織內水分子擴散的異常，表現為ADC值及FA值的降低。因此幕上腦梗死區域及遠隔區域的雙側小腦半球RGMa蛋白的持續性高表達與磁共振FA值的降低具有顯著的負相關,因此這說明RGMa蛋白與磁共振DTI檢查相結合可以用來解釋CCD發生的病理基礎。

總之，本研究通過建立大鼠MCAO模型，觀察大鼠幕上梗死核心區FA值、ADC值的降低及RGMa蛋白表達的升高，同時發現梗死遠隔區域即小腦也隨著時間變化發生相似的改變。此結果證實了磁共振DTI技術聯合RGMa蛋白的病理學檢查可以發現幕上腦梗死后CCD現象的發生，并可以解釋CCD發生的相關機制，為幕上腦梗死后觀察遠隔區域的繼發性改變提供了一種新的無創性技術。

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Diffusion tensor imaging analysis of crossed cerebellar diaschisis after cerebral infarction in rats

LIN Ya-nan,CHENG Jing-liang,ZHANG Yong,YANG Lu,ZHAO Shan-shan,ZHANG Xiao-nan
(The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China)

Objective:To detect the change of diffusion parameter in remote regions of the infarct core after middle cerebral artery occlusion(MACO)in rats using diffusion tensor imaging(DTI),to detect the RGMa protein expression of the brain tissue by immunohistochemistry,and to detect the diffusion and pathological changes of the cerebral infarction core area and bilateral cerebellar hemispheres,and to further understand the relevant mechanism of crossed cerebellar diaschisis(CCD).Methods:All the animals were random ly divided into experimental group(n=56)and control group(n=14).After making the successful model,the control group and the experimental group rats underwent MRI at 1 h,3 h,6 h,9 h,12 h,24 h and 72 h,and the expression of RGMa protein was detected by immunohistochemistry in the bilateral cerebellar hemispheres of rats.Results:The results of MRI in the experimental group at each time point after MCAO in rats showed that the FA values were all decreased in the bilateral cerebellar hemisphere compared with normal control group,and the FA values were decreased to the lowest at 12 h,and the FA value of the contralateral(right)cerebellar hemisphere was significantly lower than that of the ipsilateral(left)cerebellar hemisphere.The results of immunohistochemistry showed that the expressions of RGMa protein were increased in the bilateral cerebellar hemisphere compared with the normal control group,and the expression were increased to the peak at 24 h,and the expression of the contralateral cerebellar hemisphere was significantly higher than that of the ipsilateral cerebellar hemisphere.Conclusion:The MR DTI combined with RGMa protein pathology can be used to detect the phenomenon of CCD after supratentorial cerebral infarction,and to explain the mechanism of CCD.

Brain infarction;Rats;Magnetic resonance imaging

R743.33；R445.2

A

1008－1062（2017）04－0240－05

2016-06-23；

2016-08-10

林亞南（1987-），女，河南鄭州人，醫師。 E-mail：1208847397@qq.com

程敬亮，鄭州大學第一附屬醫院，450000。E-mail：cjr.chjl@vip.163.com