桔霉素生物合成及調控的研究進展

吳申懋，于華寧*

(1.乳業生物技術國家重點實驗室,上海 200436；2.上海乳業生物工程技術研究中心，上海 200436；3.食品安全與營養協同創新中心，上海 200436；4.光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海 200436)

桔霉素生物合成及調控的研究進展

吳申懋1,2,3,4，于華寧1,2,3,4*

(1.乳業生物技術國家重點實驗室,上海 200436；2.上海乳業生物工程技術研究中心，上海 200436；3.食品安全與營養協同創新中心，上海 200436；4.光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海 200436)

桔霉素是一種聚酮類化合物，同時也是一種常見的真菌毒素，具有腎毒性和潛在的致癌致畸風險，是青霉屬、曲霉屬、紅曲霉屬等的次級代謝產物。桔霉素的存在嚴重影響了真菌發酵工程的安全性，對食品安全造成了嚴重的威脅。因此，如何減少或抑制桔霉素的產量已成為一個研究熱點。近年來， 隨著分子生物學技術的發展，許多研究者對真菌次級代謝產物的生物合成及其調控進行了研究。文章重點介紹了桔霉素生物合成途徑及相關基因的研究進展， 為減少真菌發酵過程中桔霉素的產量，提供更優良的工業用菌株的參考和借鑒。

桔霉素;聚酮合酶;紅曲霉

桔霉素(citrinin)是一種真菌毒素，由Raistrick H和Hetherington A C于1931首次在Penicilliumcitrinum中分離得到[1]，并在1948年由Whalley W B鑒定了其化學結構(見圖1)[2]。

桔霉素的化學名為4,6-二氫-8-羥基-3,4,5-三甲基-6-氧-3-H-2-苯吡-7-羧酸，呈黃色晶體狀。作為一種真菌的次級代謝產物，桔霉素具有抑菌作用，但同時在哺乳動物中被證實對腎臟有一定毒性，攝入會導致實驗動物的腎臟增大、腎小管擴張和上皮細胞壞死等癥狀，同時還具有潛在的致畸風險[3-8]。有研究表明目前生活中攝入桔霉素的主要來源是谷物及谷物為原料的食品，見表1[9]。

表1 桔霉素在食品原料中的污染Table 1 The contamination of citrinin in food ingredients

近年來，真菌毒素在食品中的危害正越來越受到重視，相關機構普遍重視，日本針對食品和保健食品中桔霉素的含量已做出規定，不得超過200 μg/kg。

歐盟的食品安全局(European Food Safety Authority)雖然未對食品中的桔霉素含量做出確切規定，但也對桔霉素的腎毒性及可能具有的基因毒性和致畸可能性表示了關注。

目前的研究發現桔霉素可由青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、紅曲霉屬(Monascus)等代謝產生。這幾類真菌均為重要的工業用菌種，過高的桔霉素產量會對食品的質量和安全造成嚴重的影響，因此如何減少或抑制桔霉素的產生成為許多研究者研究的重點方向。

近年來，隨著真菌遺傳轉化方法的成熟、轉錄組學及代謝組學的興起，越來越多的技術正在被運用于真菌次級代謝產物的分析，桔霉素的生物合成及相關功能基因的研究也取得了不少成果。本文就桔霉素生物合成及相關的調控基因的研究進展做了綜述。

1 桔霉素的生物合成途徑

桔霉素是一種聚酮類化合物，對于真菌聚酮體代謝產物的合成途徑，目前已經有很多相關研究。與青霉屬產生的其他聚酮類化合物洛伐他丁(Lovastatin)和莫那可林(Monacolin K)一樣，桔霉素合成的前體是乙酰CoA和丙二酰CoA。Hajjaj等[10]的研究通過同位素示蹤方法追蹤標記化合物在合成過程中的積累，認為桔霉素在聚酮合酶(polyketide synthases，PKS)的作用下，1分子的乙酰CoA和4分子的丙二酰CoA縮合成四酮體(Tetraketide)，然后繼續與乙酰CoA縮合，通過甲基化、縮合、還原、甲氧基化、還原、氧化和脫水等步驟生成桔霉素(見圖2中a)。

圖2 紅曲霉中桔霉素可能的生物合成過程Fig.2 The possible biosynthesis process of citrinin in Monascus spp.

但是最新的研究對此提出了其他解釋(見圖2中b)：He Yi 等[11]認為乙酰CoA在PKS的作用下，生成結合?；d體蛋白(acyl carrier protein，ACP)的起始復合物，然后在絲氨酸水解酶(Serine Hydrolase)、氧化還原酶(Oxidoreductase)、乙醛脫氫酶(Aldehyde Dehydrogenase)、短鏈脫氫酶(short-chain dehydrogenases，SDR)的作用下生成桔霉素。

2 桔霉素合成及調控基因的研究

在真菌的次級代謝途徑中，需要很多酶的參與和調控，這些酶的編碼基因常被發現緊密排列在染色體相鄰的位置上，形成一個共同參與合成調控的基因[12]。在桔霉素等聚酮化合物的生物合成過程中，PKS基因簇起了一個關鍵作用。目前通過基因克隆等方法，對PKS基因的結構和功能已有了一個較為全面的了解。但對位于PKS基因簇的上下游，參與調控和影響桔霉素合成的其他調控基因仍有待進一步的研究。

真菌的PKS基因是一個復雜的基因簇，完整的PKS包含多個功能模塊，由多個酶和蛋白構成(見圖3)，其中包括：酮脂酰基合酶(β-ketoacylsynthase，KAS)、?；D移酶(acyl transferase，AT)、酰基載體蛋白(acyl carrier protein，ACP)、甲基轉移酶(C-methyl transferase domain，C-Met)等[13]。

圖3 聚酮合酶基因簇的功能結構Fig.3 The functional structure of polyketide synthases cluster

2005年，Shimizu等[14]對紫紅曲霉(Monacuspurpureus)PKS的全長基因進行了克隆，得到了13 kb的基因片段。他們發現PKS基因的轉錄量與桔霉素的合成量成正比，而在利用同源重組敲除PKS基因的菌株中，桔霉素的合成被抑制。更進一步的研究發現紫紅曲霉的PKS基因附近存在5個可能參與合成的開放閱讀框(orf1～orf5)，其中orf2(ctnA基因)的敲除會導致PKS基因表達的顯著下調并嚴重影響桔霉素的產量[15]。

在此基礎上，Wang等[16]發現培養紫紅曲霉時以藍光照射，能顯著提高桔霉素的產量。用RT-qPCR分析發現，在藍光照射下orf1，orf3，orf4基因在轉錄水平的表達上調，而PKS基因的表達量卻沒有顯著變化，推測在藍光照射條件下PKS基因并不是控制桔霉素產量的關鍵因素。Li等[17]以原生質體CaCl2/PEG法敲除了位于orf2和PKS之間的orf4(ctnB基因)。結果表明：3個轉化子的桔霉素產量均大幅降低，但紅曲霉及黃色素的產量與野生型相比并沒有顯著差異。隨后Li等[18]克隆了(Monascusaurantiacus)PKS基因簇附近的片段，分析后發現其中一個基因(ctnG)與米曲霉(Aspergillusoryzae)中的β-碳酸酐酶具有較高的相似性。利用同源重組敲除該基因后，桔霉素的產量下降了50%，色素的產量減少了23%，推測ctnG基因可能與色素及桔霉素的前體丙二酰CoA的合成途徑有關。國內的郭季冬和崔華[19,20]利用基因重組技術敲除了紅曲霉PKS基因簇上游的orf3基因，結果發現突變株桔霉素產量分別降低了96%和87%，同時與野生株相比，突變株的色素產量也有了顯著提高，推測是由于桔霉素合成途徑的阻斷導致底物向色素途徑轉移，從而提高色素產量。

Patrick等的研究發現在馬爾尼菲青霉(Penicilliummarneffei)中，沉默PKS基因上游的4個開放閱讀框(rp1～rp4)會導致PKS基因的表達下調，其中rp1可能是PKS基因的轉錄激活因子。研究者分別沉默了rp1～rp4和PKS基因，并使用超高效液質聯用分析次級代謝產物，結果表明rp1～rp4和PKS基因的沉默均會導致色素產量的降低，但只有rp1和PKS基因被沉默時，桔霉素的產生被抑制，國內研究者也對紅曲霉進行了類似的實驗，但在敲除了紅曲霉PKS基因后，發現其桔霉素的產量降低，但色素的產量卻有提高[21]。

此外，也有研究報道G蛋白信號通路作為真菌中普遍存在的細胞跨膜轉導途徑可能也參與了桔霉素等次級代謝產物的合成[22,23]。李利等[24]發現在紅曲霉菌株M7中，G蛋白α亞基編碼基因(Mga1)被敲除后，桔霉素的產量提高了9倍，色素的產量也提高了71%。說明Mga1編碼的G蛋白亞基可能與桔霉素和色素合成過程中的信號傳導有關。

3 影響桔霉素產量的因素

由于桔霉素對腎臟的毒性及潛在的致畸和致癌可能，許多研究者都致力于篩選無桔霉素或桔霉素產量較低的菌株，并研究外部發酵條件對菌株桔霉素產量的影響。

許多研究者發現桔霉素的產量與培養環境中的溶氧量有關。Schmidt等[25]發現在Cu2+誘導下的氧脅迫環境中，隨著Cu2+濃度的上升，青霉屬Penicilliumverrucosum的次級代謝產物由赭曲霉素A逐漸向桔霉素轉化。并證實了Penicilliumverrucosum與紫紅曲霉相同，當cAMP的量上升時，桔霉素的產生受到抑制，這說明桔霉素的合成可能受到cAMP/PKA信號通路的調控。推測桔霉素具有抗氧化性，可應對氧脅迫及氧損傷。這一結果與Hajjaj等[26]的研究相符，他們控制了紫紅曲霉(Monascusruber)發酵培養基中的溶氧量并發現當培養基中溶氧上升時，紅曲色素和桔霉素的產量顯著上升，且桔霉素產量上升大于色素。國內的朱宏軍[27]也發現紅曲中桔霉素的含量與培養基中的自由基含量成正相關，同時也觀察到當超氧化物歧化酶(SOD)活性提高時，桔霉素的產量顯著下降。研究者嘗試在紅曲培養基中人工添加抗氧化劑如β-胡蘿卜素、維生素C、EDTA等，結果表明添加后桔霉素的含量均下降了90%以上，同時提高了50%的色價。推測是由于紅曲色素和桔霉素合成途徑部分重合，當桔霉素合成被抑制時相應的色素產量就會上升。邢淑婕等[28]也發現當紅曲培養基的裝液量從75 mL提升至200 mL時，桔霉素的產量下降了90%。馬博雅等[29]在有氧與缺氧條件下分別培養紅曲霉，并監測相關基因表達的情況，結果發現與有氧培養相比，無氧狀態下的紅曲霉桔霉素產量低40.16%，且orf2基因的表達量總是低于有氧條件，orf7基因的表達量總是高于有氧條件，因此推測桔霉素的合成被orf7基因的表達抑制，而與orf2基因的表達成正相關，這與之前國外Shimizu等的研究結果一致。

Hajjaj等[30]研究了培養基中不同的氨基酸對紫紅紅曲胞外桔霉素和色素的影響。他發現除了賴氨酸外，紫紅紅曲在以其他12種常見氨基酸為氮源時均能生長，當培養基中唯一氮源為甘氨酸、酪氨酸、組氨酸時，色素的產量較高，桔霉素的產量較少；當氮源為谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸時桔霉素產量較高。其中以組氨酸為氮源時，150 h培養后紅曲色素的產量可達到715 mg/L，桔霉素未檢出。研究者推測桔霉素可能被組氨酸代謝過程中積累的過氧化氫所降解[31]。

康碧玉等[32,33]發現在紅曲霉發酵過程中的pH受氮源的影響較大，發酵液的最終pH是影響桔霉素和色素合成的關鍵因素。隨著發酵液的pH增大(pH 3.0～5.5)，胞外的色素濃度也增高。當發酵液最終pH低于3.0時，桔霉素的生物合成被抑制。同時有研究者發現：紫紅紅曲的桔霉素和色素產量在pH 5.5上升至pH 8.0時，下降了90%和60%[34]，說明過酸(<3.0)或過堿(>8.0)的環境均能有效抑制桔霉素的合成。岳建明等[35]的研究也發現添加0.3 mol/L NH4+的(NH4)2SO4的發酵液中桔霉素含量降為0.05 mg/L，較對照組降低88.6%，說明在培養基中添加銨鹽可以通過降低pH的方式減少桔霉素的產生。

Tan等[36]在紫紅紅曲培養基中添加4%的乙醇后，發現紅曲的桔霉素產量從38 mg/kg減少至2 mg/kg，但菌體干重卻上升50%，說明聚酮類化合物的產量減少并非通過抑制菌體生長而是改變了紅曲的代謝通路。此外，研究者以2D-PAGE分析加入4%乙醇后對蛋白表達的影響，發現除了聚酮合酶相關蛋白的表達下調外，乙醛脫氫酶和脂肪酸合酶的表達也有顯著下調。推測乙醇對于桔霉素產量的下調不僅靠阻斷聚酮合酶合成的通路，同時也降低了聚酮類化合前體(乙酰CoA)的合成。

張曉偉等[37]發現分別以藍光和日光照射8 h后，桔霉素的保存率為64%和76%；而以紫外光照射5 min后，桔霉素的降解就會達到50%。推測由于桔霉素的最大吸收峰在330 nm波長處，可以吸收紫外和藍光的光量子，從而導致桔霉素的降解。

4 展望

近年來，隨著超高效液相色譜等分離技術的發展，對桔霉素合成過程中的步驟已有了較為全面的研究，但是桔霉素的合成調控的詳細機理仍未得到闡明。許多的研究已發現桔霉素的合成并非僅依靠PKS基因簇，可能涉及到多個信號通路的協同作用，包括跨膜的G蛋白信號轉導、cAMP信號通路等。這些研究說明桔霉素的合成與外界環境之間的緊密聯系，為下一步通過特定的培養基成分或培養條件定向調節真菌桔霉素產量奠定了基礎。

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Research Progress on Biosynthesis and Regulation of Citrinin

WU Shen-mao1,2,3,4, YU Hua-ning1,2,3,4*

(1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology, Shanghai 200436, China;2.Shanghai EngineeringResearch Center of Dairy Biotechnology, Shanghai 200436, China;3.Synergetic InnovationCenter of Food Safety and Nutrition Dairy Research Institute, Shanghai 200436, China;4.Bright Dairy & Food Co., Ltd., Shanghai 200436, China)

Citrinin is one of the well-known mycotoxins and polyketides, which has been proved to be nephrotoxic and potentially embryocidal and carcinogenic. It is a secondary metabolite produced by several fungal strains belonging to the generaPenicillium,AspergillusandMonascus. The contamination of citrinin now threatens the food safety and fungus fermentation. Therefore, how to reduce and eliminate the production of citrinin has become a hot topic.In recent years, with the development of molecular biological approaches, many researchers have explored the biosynthesis and regulation of fungal secondary metabolites. The latest achievements are summarized in this paper, which has set up the foundation for reducing the production of citrinin in fungus fermentation and providing high-efficient industrial fungal strains.

citrinin;polyketide synthase;Monascus

2017-02-03 *通訊作者

上海優秀技術帶頭人項目(14XD1420300)

吳申懋(1989-)，男，碩士，研究方向：微生物與食品安全；

于華寧(1981-)，男，博士，研究方向：微生物與食品安全。

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.039

1000-9973(2017)08-0175-06