芍藥內酯苷對大鼠坐骨神經雪旺細胞的保護作用研究＊

王東超，魏穎，高佳琪，劉一冰，屈玲霞，劉永巧，徐暾海＊＊，劉銅華

芍藥內酯苷對大鼠坐骨神經雪旺細胞的保護作用研究＊

王東超1,2,3，魏穎1,2,3，高佳琪1,2,3，劉一冰1，屈玲霞1,2,3，劉永巧1,2,3，徐暾海1,2,3＊＊，劉銅華2,3

（1.北京中醫藥大學中藥學院北京100029；2.北京中醫藥大學中醫養生學教育部重點實驗室北京100029；3．北京中醫藥大學中醫養生學北京市重點實驗室北京100029）

目的：探討糖痹康顆粒中主要成分芍藥內酯苷對大鼠坐骨神經雪旺細胞（Schwann Cells，SCs）的影響作用。方法：本實驗通過不同濃度的葡萄糖對大鼠坐骨神經雪旺細胞的影響的研究，建立了以150 mmol·L-1D-葡萄糖，培養時間為48 h的細胞氧化應激模型，通過設立芍藥內酯苷高中低組（100 μM、20 μM、4 μM），模型組，維生素C組（100 μM），正常組，利用流式細胞儀定量檢測細胞內ROS含量和熒光顯微鏡定性觀察細胞內ROS狀態以及CCK-8檢測細胞活性。結果：采用CCK-8法檢測細胞增殖情況，48 h后，模型組與正常組有明顯的差異P＜0.01；芍藥內酯苷給藥組與模型組相比，P＜0.01；芍藥內酯苷可以促進雪旺細胞增殖。通過檢測ROS熒光含量，發現芍藥內酯苷100、20、4 μM與模型組（Glu 150 mM）相比，各組P＜0.01，表明芍藥內酯苷可以減輕雪旺細胞內ROS，緩解氧化應激狀態。結論：芍藥內酯苷可以通過增加雪旺細胞增殖，改善氧化應激狀態對雪旺細胞產生保護作用。

糖痹康顆粒芍藥內酯苷雪旺細胞神經保護

糖痹康顆粒（專利申請號：200810167551.1）主要由黃芪、桂枝、黃連、延胡索、雞血藤、黃芩、女貞子、水蛭9味中藥組成，具有益氣養陰、解毒化瘀通絡之功效，治療糖尿病周圍神經病變（Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN）具有良好的臨床效果[1-3]。雪旺細胞（SCs）是周圍神經系統中有利于神經修復的主要神經膠質細胞，支持和保護軸突，維持著神經軸突的微環境，形成髓鞘，加速神經軸突的傳導速度，對神經有營養作用，在周圍神經損傷、再生和修復中，起著重要的作用。因此，SCs成為國內外研究周圍神經病變的熱點。本研究通過建立高糖誘導SCs致氧化應激模型，以維生素C為對照，利用流式細胞儀和熒光顯微鏡測定活性氧（ROS）含量，研究糖痹康顆粒中主要成分芍藥內酯苷對氧化應激SCs模型的影響。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

Glomax multi酶標儀（美國promega公司），HERA cell 150i CO2孵育箱（美國Thermo scientific公司），IX71倒置顯微鏡（日本Olympus公司），Sigma臺式高速低溫冷凍離心機（美國Sigma-Aldrich公司），R200D型分析天平（德國賽多利斯集團）；HDL型超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 試藥與試劑

雪旺細胞株CRL-2942TM（美國標準菌庫，ATCC，馬納薩斯，維吉尼亞州）；維生素C（上海源葉生物科技有限公司，批號：S05J6G1，HPLC≥99%）；Gibco?高糖DMEM培養基（美國Invitrogen公司）；澳洲胎牛血清（FBS）（美國ORIGIN公司）；青霉素-鏈霉素混合液（北京博奧拓達科技有限公司）；胰蛋白酶-EDTA溶液（北京博奧拓達科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京博奧拓達科技有限公司）；cck-8（日本同仁化學研究所）；D（+）-無水葡萄糖（批號：S08J6G1，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；ROS試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20161118）；96孔板，6孔板，細胞培養瓶（美國Fisher scientific公司）。

2 實驗方法

2.1 高糖體外誘導Sc損傷模型的建立

在96孔板中加入100 μL的Sc細胞懸液（1× 105個/mL）。將培養板放在培養箱預培養24 h（37℃，5%CO2）；鏡下觀察細胞，匯合率達到80%以上，將培養板中的培養基吸出，分別加入葡萄糖濃度為50 mM、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM、175 mM的DMEM培養基，加D-Glu進行配制；每組8個復孔，設置實驗分組如下：①正常對照組：含細胞、含D-葡萄糖濃度為25 mM的DMEM培養基；②50 mM葡萄糖組：含細胞、含D-葡萄糖濃度為50 mM的DMEM培養基；③75 mM葡萄糖組：含細胞、含D-葡萄糖濃度為75 mM的DMEM培養基；④100 mM葡萄糖組：含細胞、含D-葡萄糖濃度為100 m MDMEM培養基；⑤125 mM葡萄糖組：含細胞、含D-葡萄糖濃度為125 m MDMEM培養基；⑥150 mM葡萄糖組：含細胞、含D-葡萄糖濃度為150 mMDMEM培養基；⑦175 mM葡萄糖組：含細胞、含D-葡萄糖濃度為175 mMDMEM培養基。

Sc細胞在不同濃度葡萄糖的DMEM培養基中進行培養，培養時間分為12、24、48、72、96 h；12、24、48、72、96 h后，向每個培養孔中加入10 μL CCK-8溶液，按照說明書進行OD值的檢測。

2.2 實驗分組

根據實驗設計，分為以下幾組：高藥組：100 μM芍藥內酯苷，150 mM葡萄糖DMEM完全培養基；中藥組：20 μM芍藥內酯苷，150 mM葡萄糖DMEM完全培養基；低藥組：4 μM芍藥內酯苷，150 mM葡萄糖DMEM完全培養基；模型組：150 mM葡萄糖DMEM完全培養基；陽性組：100 μM維生素C，150 mM葡萄糖DMEM完全培養基；正常組：正常25 mM葡萄糖的DMEM完全培養基。

2.3 芍藥內酯苷治療高糖損傷Sc細胞活性檢測

在96孔板中加入100 μL的SCs細胞懸液（1× 105個/mL）。將培養板放在培養箱預培養24 h（37℃，5%CO2）。鏡下觀察細胞，匯合率達到80%以上，將培養板中的培養基吸出，每組10個復孔，按“2.2”項下實驗分組。SCs細胞在不同藥物濃度的DMEM培養基中進行培養48 h。48 h后，向每個培養孔中加入10 μL CCK-8溶液，按照說明書進行O.D值的檢測。

2.4 芍藥內酯苷治療高糖損傷Sc細胞內ROS檢測

2.4.1 熒光顯微鏡定性檢測

在6孔板中加入2 mL的SCs細胞懸液（1× 105個/mL）。將培養板放在培養箱預培養24 h（37℃，5%CO2）。鏡下觀察細胞，匯合率達到80%以上，將培養板中的培養基吸出，每組3個復孔，按“2.2”項下實驗分組。SCs細胞在不同藥物濃度的DMEM培養基中進行培養48 h。按照ROS檢測試劑盒說明書進行操作，用流式細胞儀檢測。

2.4.2 流式細胞儀定量檢測

在6孔板中加入2 mL的SCs細胞懸液（1× 105個/mL）。將培養板放在培養箱預培養24 h（37℃，5%CO2）。鏡下觀察細胞，匯合率達到80%以上，將培養板中的培養基吸出，每組3個復孔，按“2.2”項下實驗分組。SCs細胞在不同藥物濃度的DMEM培養基中進行培養48 h。按照ROS檢測試劑盒說明書進行操作，用流式細胞儀檢測。

3 結果

3.1 不同葡萄糖濃度的培養基對雪旺細胞增殖的影響

實驗結果表明，細胞增殖與葡萄糖濃度成濃度依賴，隨著葡萄糖濃度的增加細胞平均存活率逐漸降低，細胞增殖率降低。同一葡萄糖濃度，細胞增殖與時間呈負相關。通過表1可發現，濃度為175 mM葡萄糖在任何一個時間段均與正常組有顯著的差別，P＜0.01，表明該濃度對雪旺細胞造成很大損傷，不能采用該濃度。而濃度為50 mM、75 mM的葡萄糖96 h前與正常組沒有統計學差別（P＞0.05），表明這兩個濃度在96 h前對雪旺細胞沒有損傷。100 mM濃度的葡萄糖在72 h才有特別明顯的細胞損傷（P＜0.01），125 mM、150 mM濃度的葡萄糖在48 h也有明顯損傷（P＜0.01），為了增加氧化損傷程度，故選擇150 mM，48 h作為模型條件[4,5]。

表1 不同葡萄糖濃度對雪旺細胞增殖影響的實驗結果（xˉ,n=6）

表2 不同葡萄糖濃度下雪旺細胞平均存活率表/%

圖1 不同葡萄糖濃度培養基對細胞平均存活率的影響

圖2 AF干預雪旺細胞cck-8結果圖

3.2 芍藥內酯苷治療高糖損傷雪旺細胞的活性檢測

結果表明，如圖2所示，48 h后，模型組與正常組有明顯的差異（P＜0.01）；芍藥內酯苷100、20、4 μM組與模型組相比，P＜0.01，表明各組均可促進雪旺細胞增殖，減少高糖對雪旺細胞的損傷作用且高濃度促進作用強于低濃度。

3.3 熒光顯微鏡觀察SCs內ROS狀態

通過熒光顯微鏡觀察SCs細胞內ROS熒光狀態，可直觀觀察到模型組熒光強度高于正常組，表明模型可用。同時，給藥組各個熒光強度均弱于模型組，表明芍藥內酯苷可以緩解SCs的氧化應激狀態。

3.4 流式細胞儀檢測SCs內ROS含量

如圖所示，與正常組（Glu 25 mM）相比，各組P＜0.01；芍藥內酯苷100、20、4 μM與模型組（Glu 150 mM（相比，各組P＜0.01，表明芍藥內酯苷可以減輕雪旺細胞內ROS，緩解氧化應激狀態。

4 討論

DPN是常見的糖尿病慢性并發癥之一，發病機制復雜，但是高血糖是發病機制的中心環節。高血糖時，細胞線粒體電子傳遞超負荷和血管內皮細胞還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶激活，使ROS產生過量，引起氧化應激反應，使促氧化與抗氧化失衡，造成細胞損傷。氧化應激在DPN中的作用：①神經細胞受損，由神經內膜產生的ROS對神經細胞具有直接毒性作用；②ROS作為一種信號分子，能夠激活一系列的異常途徑的信號通路，直接或者間接作用，引起細胞結構和功能紊亂，導致神經細胞受損壞死或者凋亡。在高糖環境下大鼠坐骨神經雪旺細胞p38絲裂素活化蛋白激酶（p38 MAPK）、腫瘤壞死因子-α和可溶性血管間內皮細胞黏附分子-1水平上調，降低SOD，增加ROS和MDA。而且高糖在其他方面也會影響神經細胞的正常功能。如Lipin-1在脂質的合成代謝及其基因表達方面占有重要角色，對骨骼肌、脂肪組織和外周神經細胞內的代謝平衡發揮調節作用，影響機體糖脂代謝[6,7]。Lipin-1缺失可導致胰島素抵抗、外周神經病變、脂質代謝異常[8]，也可引起成熟的外周神經的神經外膜組成成分缺失，從而影響周圍神經髓鞘的形成，導致神經傳導速度減慢[9]。研究發現，高濃度葡萄糖可以降低體外培養的SCs增殖活性，促進細胞凋亡。在降低細胞增殖和促進細胞凋亡的同時，也伴隨著Lipin-1蛋白水平的下降。NGF可以誘導神經遞質合成，蛋白磷酸化，維持神經的正常功能，也是神經營養因子家族中最早發現的一類因子。當神經未受損傷時，雪旺細胞不會分泌NGF，但是當神經受損時，雪旺細胞就會分泌NGF，促進神經修復和增生[10]。研究發現，NGF蛋白與其受體水平的減少在高糖刺激所引起的外周神經損傷和修復過程中有重要作用[11]。雪旺細胞是由神經嵴細胞分化生成的膠質細胞，在神經損傷和修復的過程中具有重要的作用。

圖3 SCs內ROS熒光狀態

在本實驗前期研究中，已通過CCK-8法檢驗芍藥內酯苷對SCs的毒性范圍是小于500 μM，并且高中低給藥濃度已做過相關機制研究，所以最終選取100、20、4 μM，對細胞活性也無影響。通過實驗結果表明，芍藥內酯苷可以緩解SCs氧化應激狀態，可能與芍藥內酯苷可以降低細胞炎性因子TNF-α和IL-1β，抑制小神經膠質細胞的活性，減少激活的p38 MAPK信號通路的研究報道相關。

圖4 各組熒光強度圖

本實驗通過不同濃度的葡萄糖對大鼠坐骨神經雪旺細胞的影響，建立了以150 mmol·L-1D-葡萄糖，培養時間為48 h的氧化應激模型，通過設立芍藥內酯苷高中低組（100、20、4 μM），模型組，陽性藥組（100 μM），正常組，利用流式細胞儀定量檢測細胞內ROS含量和熒光顯微鏡定性觀察細胞內ROS狀態以及CCK-8檢測細胞活性，結果表明芍藥內酯苷可以改善雪旺細胞氧化應激狀態，為糖痹康顆粒藥效作用及機制研究奠定基礎。

圖5 ROS流式熒光圖

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Study onAlbiflorinActivity in Protection of Schwann Cells in Rats’Sciatic Nerve

Wang Dongchao1,2,3,Wei Ying1,2,3,Gao Jiaqi1,2,3,Liu Yibing1,Qu Lingxia1,2,3, Liu Yongqiao1,2,3,Xu Tunhai1,2,3,Liu Tonghua2,3
(1.Collage of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 2.Key Laboratory on Health Cultivation of the Ministry of Education,Beijing 100029,China; 3.Beijing Key Laboratory of Health Cultivation,Beijing 100029,China)

This paper was aimed to study the albiflorin activity of Tang-Bi-Kang(TBK)granules in protecting Schwann cells(SCs)of rat’s sciatic nerve.The establishment of SCs oxidative stress model was the condition of 150 mmol×L-1 D-glucose with different concentrations.And the incubation time was 48 h.The experiment groups were the high-dose, middle-dose and low-dose(100 μM,20 μM,4 μM)albiflorin group,the model group,the vitamin C(100 μM)group, and the normal group.Flow cytometry was used to detect the content of ROS in SCs.Fluorescence microscope was used to observe the condition of ROS fluorescence in SCs.And CCK-8 was used to detect the cell activity.The results showed that by using CCK-8 to detect cell proliferation,after 48 h,there was a significant difference between the model group and the normal group(P＜0.01);the albiflorin group compared with the model group(P＜0.01).It indicated that albiflorin can promote the proliferation of SCs.Detecting the ROS fluorescence content,it showed that compared with the model group(Glu 150 mM),the 100 μM,20 μM,and 4 μM albiflorin group,it was P＜0.01 for each group.It showed that albiflorin could relieve the ROS in SCs and alleviate oxidative stress.It was concluded that albiflorin can increase the proliferation of SCs and improve the state of oxidative stress with the protection of SCs.

Tang-Bi-Kang granules，albiflorin,Schwann cells,neuroprotection

10.11842/wst.2017.05.013

R285.5

A

（責任編輯：郭嫦娥，責任譯審：王晶）

2017-04-17

修回日期：2017-05-20

＊科學技術部國家重大新藥創制科技重大專項（2012ZX09102201-001）：治療糖尿病周圍神經病變藥物糖痹康臨床前研究，負責人：劉銅華；北京中醫藥大學創新團隊—中醫藥干預糖尿病及其并發癥研究團隊（2011-CXTD-19），負責人：劉銅華。

＊＊通訊作者：徐暾海，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥活性成分及其質量控制研究。