糖腎平含藥血清對高糖誘導腎小管上皮細胞增殖作用及RhoA/ROCK信號通路影響的研究＊

苗永輝，趙宗江，楊冠男，王婷，黃雅薇，張紫嫣

糖腎平含藥血清對高糖誘導腎小管上皮細胞增殖作用及RhoA/ROCK信號通路影響的研究＊

苗永輝，趙宗江＊＊，楊冠男，王婷，黃雅薇，張紫嫣

（北京中醫藥大學中醫學院北京100029）

目的：探討糖腎平含藥血清對高糖刺激腎小管上皮細胞增殖作用及RhoA/ROCK信號通路的影響。方法：制備鼠含藥血清；培養腎小管上皮細胞分為：正常組，高糖組，抑制劑（Y27632）組，厄貝沙坦組，糖腎平低、中、高劑量組，3000細胞/孔種于96孔板，每組8個復孔，12、24、48、60 h觀察細胞，MTT法檢測細胞增殖。Western blotting檢測腎小管上皮細胞中RhoA、ROCK1、α-SMA和E-Cadherin蛋白的表達。結果：高糖誘導后細胞呈梭型或不規則三角形；含藥血清干預后，細胞呈扁平不規則多角形。MTT：12 h，與正常組比，各組OD值升高；24、48、60 h，與正常組比，高糖組OD值顯著升高（P＜0.01）；與高糖組比，各治療組OD值有不同程度降低（P＜0.05），48 h，與Y27632組、厄貝沙坦組和糖腎平高劑量組比，糖腎平低、中劑量組OD值降低（P＜0.05）；60 h，與Y27632組比，糖腎平中劑量組降低；與厄貝沙坦組比，糖腎平各劑量組OD值降低（P＜0.05）；與糖腎平高劑量組比，糖腎平低劑量組升高（P＜0.05）。Western blotting，與正常組比，高糖組E-Cadherin蛋白表達減少，RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白表達增加（P＜0.01）；與高糖組比，各組E-Cadherin蛋白表達增加，RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白表達減少，高劑量組有顯著差異（P＜0.01）；與Y27632組比，糖腎平高劑量組ROCK1、E-Cadherin和α-SMA蛋白表達無統計學差異（P＞0.05），RhoA蛋白表達減少（P＜0.01）；與厄貝沙坦組比，糖腎平高劑量組RhoA、ROCK1、E-Cadherin和α-SMA蛋白表達無統計學差異（P＞0.05）。結論：糖腎平通過抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞增殖和RhoA/ROCK信號通路相關分子的表達，從而逆轉上皮-間質轉分化，抑制腎間質纖維化，延緩糖尿病腎病病情進展。

糖腎平腎痿腎小管上皮細胞株KKAy小鼠細胞增殖MTT EMTRhoA/ROCK信號通路

隨著社會經濟發展、飲食結構以及生活方式的改變，糖尿病（Diabetic Mellitus，DM）發病率不斷攀升，中國在過去30年，DM發病率急速上升，約0.92億成年人罹患DM，20%～30%發展為糖尿病腎病（Diabetic Kidney Disease，DKD），并最終成為終末期腎病（End Stage Renal Disease，ESRD）的主要原因[1]。目前對DKD的治療，西醫主要釆取血管緊張素轉化酶抑制劑（Angiotension Converting Enzyme Inhibitors，ACEI）和血管緊張素受體阻滯劑（Angiotensin Receptor Blocker，ARB）聯合治療來降低蛋白尿，但其安全性和對腎臟病進展的影響尚不清楚，中醫藥治療DKD有獨特的優勢，在臨床廣為應用[2]，我們課題組前期的研究選取SD大鼠、Wistar大鼠和KKAy小鼠3個品種的實驗動物以及大鼠腎小球足細胞和小鼠腎小管上皮細胞2個品種的實驗細胞，研究涉及從下調糖尿病腎病腎組織中單核細胞趨化因子-1（Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），減少細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）在腎小球系膜區以及腎小管間質的沉積、修復足細胞損傷、抑制足細胞凋亡、逆轉足細胞轉分化和抑制腎小管上皮細胞轉分化等五大方向，研究結果表明，無論是整體動物實驗中還是體外細胞實驗中，在“腎痿”科學假說指導下組方的糖腎平均展示出了良好的腎臟保護作用和DKD治療效果[3]。DKD時，腎小管上皮細胞受損，損傷后的細胞增殖能力增強，有兩種發展方向，一是通過細胞增殖，產生與損傷前細胞類型一樣的細胞，補充功能缺陷的細胞；二是細胞增殖后發生轉分化，形成其他類型的細胞，如成纖維細胞，該轉分化后的細胞遷移到腎間質分泌大量細胞外基質，加速DKD的病理進程[4]，因此我們推測，通過抑制細胞增殖實驗，可以間接說明腎小管上皮細胞轉分化的科學問題。腎小管上皮細胞轉分化是DM引起腎損害的重要病理機制，有研究表明高糖能激活RhoA/ROCK信號轉導通路上的關鍵分子Ras同源基因家族成員A（RasHomolog Gene Family Member A，RhoA）和Rho相關卷曲蛋白激酶（Rho-Associatedcoiled-Coil-Containing Protein Kinase 1，ROCK1），介導腎小管上皮細胞-間質轉分化（Epithelial-to-Mesenchymal Transition，EMT）的發生[5]，本研究探討糖腎平含藥血清對高糖誘導腎小管上皮細胞增殖作用及RhoA/ROCK信號通路的影響，為“腎痿”科學假說提供新的實驗依據。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與試劑

倒置顯微鏡（日本Olympus公司)，超凈工作臺（北京市昌平長城空氣凈化設備公司），恒溫CO2培養箱（編號：B5060EK/CO2，德國產），0.22μm濾器（Millipore，R6MA90693），離心機（Germany，MIKR220R），25 cm2培養瓶（Corning，4306301），450型自動酶標儀（MuLtiskanAseentvl.24345-00627T）（美國百特公司）；BIO-RAD成像系統（美國Bio-Rad公司）。

RPMI1640培養基（Roswell Park Memorial Institute 1640）（Gibco，貨號/批號：31800-022/1786043）、胰蛋白酶1:250（Amresco，貨號/批號：0458-25G/1554C333）；胎牛血清（HyClone，貨號/批號：SV30087.01/ NZE1145）；碳酸氫鈉（北京化學試劑公司，產品批號：030918）；MTT（4-甲基偶氮唑藍，Amresco，貨號/批號：0793/20120308418）；DMSO（Amresco，貨號/批號：0231-500ML/2075C127）；EDTA·2Na（北京鼎國生物技術發展中心生產，產品批號：C087），青鏈霉素混合液（Solarbio，貨號：P1400），右旋葡萄糖（D-GLU, Amresco，貨號/批號：0188-500G/1056C459），通用型蛋白酶抑制劑（MERCK，539134）；蛋白抽提試劑（MERCK，71009-3CN）；BCA法蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，貨號/批號：P1511/ 20151511052003）；一抗β-actin（美國Cell Signaling Technology公司，貨號/批號：4970/0011）；RhoA（美國Novus Biologicals公司，貨號/批號：NB100-91273/ Rb0322-200308-WS）；ROCK1（英國Abcam公司，貨號/批號：ab134181/GR149410-2）；α-SMA（英國Abcam公司，貨號/批號：ab32575/GR32377-41）；E-Cadherin（英國Abcam公司，貨號/批號：ab76055/GR216035-1）；二抗山羊抗兔（英國Abcam公司，貨號/批號：ab6721/ GR231489-1）；山羊抗鼠（英國Abcam公司，貨號/批號：ab6789/GR215715-5）；ECL超敏發光液（德國MerckMillipore公司，貨號/批號：WBKLS0100/1316802）。

1.2 實驗藥物與細胞

糖腎平（生黃芪6 g、熟地黃3 g、山萸肉2 g、翻白草3 g、白花蛇舌草3 g、水蛭2 g，北京中醫藥大學中藥學院制劑室制備，批號：2016008，具體制備工藝見參考文獻[4]）；厄貝沙坦片（賽諾菲安博維，國藥準字J20130 049）；Y27632（美國Sigma，批號：046M4746V）。C57BL/ 6小鼠近端腎小管上皮細胞株（美國ATCC，4100-57）。

2 實驗方法

2.1 制備含藥血清

15只Wistar大鼠，雄性，SPF級，體重（500±20）g，根據體重分層隨機分為正常組，厄貝沙坦組，糖腎平低、中、高劑量等5組，每組3只，依據人臨床用藥劑量，糖腎平各組分別按人臨床用藥劑量3.5倍（0.525 g/kg）、7倍（1.05 mg.kg-1）、14倍（2.1 g.kg-1）灌胃給藥；厄貝沙坦組按人臨床用藥劑量7倍（17.5 g.kg-1）灌胃給藥，給藥組每天灌胃給藥1次，正常組灌等量的生理鹽水，連續灌胃7天，末次給藥后2 h采血，分離血清，-20℃保存備用。

2.2 細胞復蘇

取出凍存的細胞，在手中快速搓成冰水狀，37℃水浴片刻；加無血清的164 0培養基10 mL，100 0 rpm離心3 min，棄上清，重復一次；加含10%胎牛血清的164 0培養基置于恒溫CO2培養箱進行培養。

表1 實驗分組及具體情況

2.3 細胞傳代

培養箱取出培養瓶，鏡下觀察細胞生長至80%；0.25%胰蛋白酶1 mL，消化2 min，迅速移入超凈臺加1.2 mL含10%胎牛血清的1640培養基終止消化；轉入15 mL離心管，100 0 rpm離心2 min，棄上清；加含10%胎牛血清的1640培養基，分裝于新的細胞培養瓶繼續培養。

2.4 實驗分組

根據加入培養體系中血清的不同，分為正常組、高糖組、抑制劑（Y27632）組、厄貝沙坦組、糖腎平低劑量組（糖腎平低組）、糖腎平中劑量組（糖腎平中組）和糖腎平高劑量組（糖腎平高組），具體信息見表1。

2.5 倒置相差顯微鏡下觀察小鼠腎小管上皮細胞形態的改變

將培養板置于顯微鏡載物臺，目鏡為10×，先用4×物鏡觀察，再用10×物鏡觀察腎小管上皮細胞形態，上下左右依次進行觀察，統一選取培養板中央部位拍照。

2.6 MTT法檢測細胞增殖

待細胞整體分布密度已經達到80%左右時，用0.25%的胰酶1mL消化細胞，6%FBS的RPMI 16401.3mL終止消化；按每孔200 μL6%FBSRPMI1640液3000個細胞種植于96孔培養板上，每組設8個復孔，4塊復板，分加于加樣孔中，置孵箱孵育24 h，吸出培養液，換無血清RPMI1640液每孔200 μL培養，同步24 h；吸棄培養基，按以上細胞分組情況加入各組相應的培養基成分，每組8個復孔；細胞繼續培養12、24、48、60 h后取出細胞板，甩去培養基，每孔加入10 μL終濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液及190 μL無血清1640培養基；繼續培養4 h；甩去培養基，室溫避光加入200 μL/孔的二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide,DMSO），輕輕震蕩10 min；用450型自動酶標儀上檢測各組細胞OD值（波長為492 nm）。

采用Western blotting檢測各組腎小管上皮細胞中RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cadherin蛋白的表達。

一抗稀釋濃度分別為：β-actin 1：2000、RhoA 1：500、ROCK1 1：500、α-SMA 1：2000、E-Cadherin 1：1000。電泳80 V，30 min左右，藍色指示劑到達濃縮膠下緣時，調節電壓為120V繼續電泳1.5 h左右終止電泳。恒壓轉膜60 V 2 h[14]。

2.7 圖像分析

采用Image J分析軟件對Western blot圖像進行分析。

2.8 統計學方法

實驗結果采用xˉ±s表示，所有實驗數據均采用SPSS 22.0進行單因素方差分析。

3 結果

3.1 小鼠腎小管上皮細胞形態

正常小鼠腎小管上皮細胞胞體呈扁平不規則多角形，中央圓形核，細胞融合呈鵝卵石狀；高糖誘導下，細胞胞體呈梭形或不規則三角形，生長時呈放射狀；相應含藥血清干預后，細胞的形態由拉長的梭形或不規則三角形向扁平不規則多角形發展。結果見圖1。

3.2 MTT法結果

各組加入相應的含藥血清培養，24 h，與正常組相比，高糖組OD值升高（P＜0.01）；與高糖組比較，各治療組均有不同程度的降低（P＜0.05）；48 h，與正常組比較，高糖組升高（P＜0.01）；與高糖組比較，各治療組均有不同程度的降低，糖腎平高劑量組（P＜0.05），其余各治療組（P＜0.01）；與與Y27632組、厄貝沙坦組和糖腎平高劑量組比較，糖腎平低劑量組和中劑量組OD值降低（P＜0.05）；60 h，與正常組比較，高糖組升高，（P＜0.01）；與高糖組比較，各治療組均有不同程度的降低（P＜0.05），；與厄貝沙坦組比較，糖腎平各劑量組降低（P＜0.05）；與Y27632組比較，糖腎平中劑量組降低；與糖腎平高劑量組比，糖腎平低劑量組升高（P＜0.05），見表2。

3.3 RhoA和ROCK1蛋白表達

高糖組腎小管上皮細胞內RhoA和ROCK1蛋白表達明顯高于正常組（P＜0.01）；與高糖組比，厄貝沙坦組和Y27632組ROCK1表達降低（P＜0.01），厄貝沙坦組RhoA表達也降低（P＜0.01），糖腎平含藥血清各治療組腎小管上皮細胞中RhoA和ROCK1蛋白表達較少，高劑量組療效最優（P＜0.01）。

圖1 各組小鼠腎小管上皮細胞形態及增殖情況（×100）

表2 糖腎平含藥血清對高糖誘導腎小管上皮細胞12、24、48 h、60 h增殖的影響（xˉ±s，n=7，OD值）

3.4 α-SMA和E-Cadherin蛋白表達

與正常組相比，高糖組腎小管上皮細胞中E-鈣黏素（E-Cadherin,E-Cad）蛋白表達減少，α平滑肌肌動蛋白（α-Smooth muscle actin，α-SMA）蛋白表達增加（P＜0.01）；與高糖組比，厄貝沙坦組和Y27632組α-SMA蛋白表達明顯降低，E-Cadherin蛋白表達增多（P＜0.01）；與高糖組相比，糖腎平高劑量組腎小管上皮細胞中α-SMA蛋白表達降低，E-Cadherin蛋白表達增加（P＜0.01），在各劑量組中效果最優。（表3、圖2）。

表3 糖腎平對高糖誘導小鼠腎小管上皮細胞RhoA/ROCK通路蛋白表達的影響（OD，xˉ±s）

圖2 糖腎平對高糖誘導小鼠腎小管上皮細胞RhoA、ROCK1、α-SMA、E-CAD蛋白表達的影響

4 討論

DKD時，高糖、氧化應激和血流動力學異常等引起腎小管上皮細胞結構損傷及功能障礙，受損傷的細胞增殖能力增強，增殖后的細胞有兩種發展方向，可通過細胞增殖產生與損傷前細胞類型相同的細胞，對受損傷的腎小管上皮細胞進行補充；或者在增殖后進一步發生上皮-間質轉分化，形成成纖維細胞從基膜遷移到腎間質，并分泌大量細胞外基質以及分泌致纖維化生長因子加重腎臟異常免疫應答反應，從而加重DKD腎臟損傷和病情惡化[6-8]。因此，通過抑制腎小管上皮細胞增殖，能夠在一定程度上抑制其轉分化；伴隨著上皮-間質轉分化現象的出現，與轉分化密切相關的信號轉導通路如RhoA/ROCK等被激活，加劇DKD的病理進程[9-11]，高糖可激活RhoA/ROCK通路，介導EMT的發生[12]。RhoA為小分子鳥苷酸結合蛋白，起“分子開關”的作用，ROCK1是其最重要和最直接的效應分子[13,14]。

導師趙宗江教授提出的DKD“腎痿”假說認為DKD日久，則熱、郁、痰濕、瘀血、毒邪相互膠結于腎臟，阻滯氣血運行，使腎臟的結構破壞，“腎體”受損，結構是功能正常行使的前提和基礎，“腎體”受損，腎臟的結構破壞必然最終導致腎臟正常功能受損甚至喪失，即“腎用”失常，“腎體”和“腎用”均受到損害，腎臟痿廢不用，發為“腎痿”，其不僅概括了病機，也描述了疾病的最終狀態。“腎痿”與諸多臟腑有關，與肝、脾、腎三臟關系最為密切，尤以脾腎最為關鍵。該病本為陰虛燥熱，若失治誤治，導致病情進一步發展，既損傷陰津，又耗損正氣，正氣日漸耗而致氣陰兩虛；病變中晚期，腎精虧虛，精不化血，日久陰損及陽，繼而發展為脾腎陽虛，脾胃虛弱，生化乏源，導致血虛，形成氣血虧虛，最后導致五臟之氣皆虛，氣血陰陽俱衰。實證方面，因腎氣不足，不能氣化和通調水道而致水濕停留，濕郁久化熱，濕熱內蘊，毒瘀結聚于腎，發為本病，故本病病性總屬本虛標實，但臨床上虛實夾雜的情況非常多見。虛則以正氣虧虛為本，實則以痰濁、濕熱、瘀毒結聚為標，并且貫穿于“腎痿”整個發展過程，其中瘀血是引起并導致DKD“腎痿”不斷發展的最關鍵致病因素。許慎《說文解字》中說，“瘀，積血也”，消渴腎病遷延日久，陰虛燥熱耗傷氣陰，導致氣陰兩虛，結合“久病入絡”理論，氣虛則行血無權，陰虛則火旺傷津，血行瘀滯，初為氣陰兩虛，后由虛致實，瘀血內生，阻滯腎絡[15]，反映在腎臟病理表現上則可見腎小球硬化，腎小管上皮細胞重吸收障礙，空泡樣變，間質纖維化等。在“腎痿”假說的指導下組方的糖腎平，藥物組成有生黃芪、熟地黃、山萸肉、白花蛇舌草、翻白草、水蛭。方中黃芪能健脾益氣、利水消腫、固攝精微、減少尿蛋白，為方之君藥；山萸肉、熟地黃共同補益肝腎、生津益氣為臣藥；白花蛇舌草、翻白草清熱解毒、消痛散結、利尿除濕為佐藥；水蛭為使，活血通經，以引諸藥直達腎絡。全方以滋補肝腎、益氣固精為主，兼以活血化瘀通腎絡，全方補而不滯，祛瘀而不傷正，治療DKD之氣陰兩傷、瘀血阻絡、精微下泄者效果尤其顯著。

本實驗結果表明，12 h時作用時間較短，高糖的誘導作用和藥物的干預作用還未能充分顯現出來；24 h高糖誘導下的腎小管上皮細胞增殖活躍，各個藥物對高糖誘導下的腎小管上皮細胞增殖有不同程度的抑制作用，但各自的藥物作用特點尚未顯現；48 h糖腎平低、中劑量對細胞增殖的抑制作用較強；60 h糖腎平中劑量組對高糖誘導下的腎小管上皮細胞增殖的抑制作用最強E-cadherin是維持上皮細胞完整性和極性最重要的組件之一，α-SMA是間充質細胞標志物，RhoA/ ROCK通路激活可致E-cadherin表達減少，有利于腎小管上皮細胞遷移至腎間質，發生表型轉變后形成肌成纖維細胞，大量表達α-SMA。ROCK特異性抑制劑Y27632通過抑制ROCK活性來抑制轉分化時RhoA/ ROCK信號通路的激活，上調E-Cadherin的表達，下調α-SMA的表達，從而抑制EMT過程。高糖誘導的小鼠腎小管上皮細胞RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白呈現高水平表達，而與此同時E-Cadherin蛋白呈現低水平表達，糖腎平含藥血清可以降低高糖誘導的小鼠腎小管上皮細胞RhoA和ROCK1蛋白表達并且降低α-SMA蛋白表達水平，升高腎小管上皮細胞標志蛋白ECadherin蛋白表達水平，糖腎平高劑量組效果最優。糖腎平對小鼠腎小管上皮細胞增殖有明顯的抑制作用，細胞增殖可能參與了上皮-間質轉分化的過程。因此，糖腎平通過抑制細胞增殖和RhoA/ROCK信號轉導通路，可以逆轉腎小管上皮細胞轉分化過程，抑制DKD腎間質纖維化，延緩其病情進展。糖腎平是中藥復方制劑，其多靶點作用機制有待進一步實驗證實。

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Effect of Tangshenping Medicated Serum on Proliferationand RhoA/ROCK Signaling Pathway of High Glucose-induced Epithelial Cells of Renal Tubules

Miao Yonghui,Zhao Zongjiang,Yang Guannan,Wang Ting,Huang Yawei,Zhang Ziyan
(College of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

To study the effect of the Tangshenping containing serum on the proliferation of the high glucose-induced epithelial cells of renal tubules.To prepare durg-contained serum from rats to enter into in vitor reaction system,the cellscultured via 10%FBS-RPMI 1640 were randomly divided into 7groups:the normal group,themodel group,the Y27632 group,theirbesartangroup,the small dose Tangshenping group,the medium dose Tangshenping group and the high dose Tangshenping group and The cells were cultured in 3000 cells/well and grown in 96-well plates.Each group had 8 wells,then detect the effects of all serum sections on the proliferation of high glucose-induced epithelial cells of kidney tubules by the MTT colorimetric method after cultured for 12 h,24 h,48 h,and 60 h.Based on the results above, cell protein were extracted from each group at 24 h,and the expression of RhoA,ROCK1,α-SMA and E-cadherin in each group were detected by Western blotting.After high glucose stimulation,the shape of cell was shuttle-like or irregular triangle,the way it grew was radial;after the intervention of the corresponding serum,the shape of the cell was flat and irregular polygonal.Started with 12h,compared with the normal group,OD value of other groups increased;at the 24h、48hand 60h,compared with the normal group,OD value of high glucose groupincreased significantly(P＜0.01); compared with the high glucose group,OD value of treatment groups decreased(P＜0.05);and 48 h,compared with the Y27632group,irbesartan groupand Tangshenping high dose group,OD value of Tangshenping low and medium dose groups decreased(P＜0.05);60 h,compared with Y27632 group,OD value of Tangshenping medium dose groups decreased;compared with irbesartan group,OD value of o Tangshenpinggroupsdecreased(P＜0.05);compared with Tangshenping high dose group,OD value of Tangshenpinglow groupsdecreased(P＜0.05)Western blotting analysis showed that compared with normal group,the expression of E-Cadherin protein in high glucose group reduced,and the expression of RhoA,ROCK1 and α-SMA protein increased;compared with high glucose group,the expression of ECadherin protein in each treating group increased,and the Tangshenping large dose group wassignificantly different(P＜0.01);the expression of RhoA,ROCK1 and α-SMA protein reduced,Tangshenping,the large dose group was significantlydifferent(P＜0.01);Compared with the Y27632 group,the expression of E-cadherin,ROCK1 and α-SMA protein in Tangshenping large dose group had no significant difference,while the expression of RhoAproteinreduced(P＜0.01).Compared with theirbesartan group,the expression of E-cadherin,RhoA,ROCK1 and α-SMA protein in Tangshenping large dose group had no significant difference(P＞0.05).The Tangshenping containing serum is abletoinhibit the proliferation of high glucose-induced epithelial cells of kidney tubules,and can reverse renal tubular-epithelial cell transdifferentiation via regulating RhoA/ROCK signaling pathway,and restrain renal interstitial fibrosis,thereby delaying the pathogenesis of diabetic kidney disease.

Tangshenping,consumptive kidney disease,renal tubular epithelial cellline,KKAy Mouse,cell proliferation, MTT,EMT,RhoA/ROCK signaling pathway

10.11842/wst.2017.06.026

R285.5

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：王晶）

2017-06-01

修回日期：2017-04-20

＊國家自然基金委面上項目（81373831）：基于“腎痿”組方的糖腎平干預糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉分化的分子機制研究，負責人：趙宗江。

＊＊通訊作者：趙宗江，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫藥防治糖尿病腎病的機制研究；苗永輝，碩士研究生，主要研究方向：中醫藥防治糖尿病腎病的機制研究。