糖腎寧對糖尿病腎病KKAy小鼠的腎臟保護作用及其對Notch/Snail1信號轉導通路的影響＊

楊冠男，趙宗江，張新雪，楊美娟

糖腎寧對糖尿病腎病KKAy小鼠的腎臟保護作用及其對Notch/Snail1信號轉導通路的影響＊

楊冠男，趙宗江＊＊，張新雪，楊美娟

（北京中醫藥大學中醫學院北京100029）

目的：明確糖腎寧是否通過干預Notch/snail1通路抑制KKAy小鼠糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉分化腎間質纖維化。方法：KKAy小鼠30只，經過10周專用鼠料飼養，血糖＞16.7 mmol·L-1，24 h尿蛋白＞0.4 mg為糖尿病腎病動物模型。造模成功小鼠按血糖和體質量分層隨機分為模型組、厄貝沙坦組與糖腎寧組，灌胃給藥，雌性C57BL/6J小鼠10只作為正常對照組。檢測小鼠一般狀況，稱體重、測24 h尿蛋白定量。干預16周后取材，檢測血糖、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）、血清肌酐（Serum creatinine，Scr）；腎組織行HE、Mallory染色。原位雜交及Western blotting法檢測小鼠腎組織中Notch/snail1通路、α-SMA、E-Cadherin蛋白及mRNA表達。SPSS20.0軟件進行統計學處理。結果：與模型組比較，糖腎寧組小鼠一般狀態改善，體質量、24 h尿蛋白定量顯著減少（P＜0.01），血清BUN及Scr含量降低（P＜0.01，P＜0.05），病理染色顯示腎間質纖維化明顯減輕，糖腎寧組腎組織Notch/snail1通路和α-SMA蛋白及mRNA表達明顯降低，有顯著統計學差異（P＜0.01），E-Cad蛋白及mRNA表達顯著升高（P＜0.01）。結論：糖腎寧可以保護糖尿病腎病腎功能，延緩糖尿病腎病進展，抑制糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉分化腎間質纖維化，改善糖尿病腎病EMT的機制可能是通過抑制Notch/snail1通路表達實現。

糖尿病腎病糖腎寧腎痿KKAy小鼠腎小管上皮細胞轉分化Notch/snail1信號轉導通路

糖尿病已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤后的第三大威脅人類健康的慢性非傳染性疾病，它所帶來的多種并發癥尤其是糖尿病腎病嚴重影響了人們的生活質量[1]，糖尿病腎病的最終結局為終末期腎病，而腎間質纖維化是各種慢性腎臟疾病進展到終末期腎衰時的共同途徑和主要的病理改變[2]；超過1/3的間質成纖維細胞是由局部腎小管上皮細胞發生的上皮-間質轉分化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT）而來，所以EMT可能是導致腎間質纖維化發生的最重要的機制之一[3]。EMT是一個非常復雜的過程，有大量的基因、分子、蛋白、通路參與其中。形成了互相聯通影響的復雜的網絡調控系統，Notch通路及核轉錄因子snail1被證實是糖尿病腎病中介導上皮細胞轉分化和體內其他細胞纖維化的重要分子[4,5]。就目前治療手段及藥物來看，現代醫學治療糖尿病腎病主要降糖、降壓、降脂類及抗炎癥角度進行治療，療效多一般，不良反應眾多，作用機制也不是很明確，并且藥物多是作用于糖尿病腎病早期，對糖尿病腎病后期腎小管上皮轉分化及腎間質纖維化研究甚少。大量的研究表明，中醫藥治療糖尿病腎病的臨床應用十分廣泛，中醫學在辨證論治、個體化治療方面有相當優勢。導師趙宗江教授研究總結大量文獻資料，并結合其多年豐富的臨床經驗，提出糖尿病腎病“腎痿”假說，發現氣陰兩虛、痰瘀互結為糖尿病腎病的主要證型，并由理論指導臨床，糖腎寧既是根據“腎痿”假說組方遣藥，臨床治療糖尿病腎病療效顯著[6]。本實驗應用類似于人2型糖尿病病理過程最為類似的KKAy小鼠作為模型，研究糖腎寧對DN KKAy小鼠腎臟保護作用及對Notch/snail1信號轉導通路的調控作用，以期為研究糖腎寧防治DN的機制及“腎痿”假說提供新的實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

30只SPF級8-10周齡健康雌性KKAy小鼠和10只SPF級8-10周齡健康雌性C57BL/6J小鼠均購自北京華阜康生物科技有限公司，許可證編號：SCXK京2014-0004；KK鼠專用配合飼料（北京華阜康生物科技有限公司，專利號：CN102648734A，11003800003551）；普通鼠飼料（北京華阜康生物科技有限公司，11003800004265）。實驗小鼠置于潔凈動物櫥（北京文慧凈化設備廠制造，專利號：EJ932041477）中飼養，適應性喂養1周，普通飼料進食，自由飲水。

1.2 主要試劑

糖腎寧（熟地黃6 g、山萸肉3 g、懷山藥3 g、杜仲2 g、炒白芍2 g、淫羊藿2 g、水蛭2 g、酒大黃2 g，北京中醫藥大學中藥學院制劑室制備，批號：2016019）；厄貝沙坦片（賽諾菲制藥有限公司，國藥準字J20130049）。免疫組化及Western Blotting一抗：Jagged1（美國Novus公司，批號：NB600-1161）；Notch1（英國Abcam公司，批號：ab52627）；Hes1（美國Cell Signaling公司，批號：11988）；Snail1（美國Novus公司，批號：NBP1-80022）；α-SMA（英國Abcam公司，批號：ab32575）；E-Cadherin（英國Abcam公司，批號：ab76055）；山羊血清封閉液（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：WK153325）；Triton（美國Sigma公司，批號：9002-93-1）；二抗：山羊抗兔（英國Abcam公司，批號：ab6721）；山羊抗鼠（英國Abcam公司，批號：ab6789）；Jagged1、Notch1、Hes1、snail1、E-Cad、α-SMA原位雜交試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。通用型蛋白酶抑制劑混合物-濃縮液型（德國Merck公司，批號：539134）；蛋白抽提試劑（德國Merck公司，71009-3CN）；5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（北京普利萊基因技術有限公司，批號：B1012）；甲叉丙烯酰胺（美國Ameresco公司，批號：2890B065）；4×濃縮膠buffer（北京普利萊基因技術有限公司，批號：B1003）；TEMED（美國Ameresco公司，批號：0761-50 mL）；4×分離膠緩沖液（北京普利萊基因技術有限公司，批號：B1004）；甘氨酸（美國Ameresco公司，批號：0903C253）；過硫酸銨（北京普利萊基因技術有限公司，批號：A1004）；甲丙烯酰胺（美國Ameresco公司，批號：1209B082）；SDS（美國Ameresco公司，批號：1380B247）；Tris（美國Ameresco公司，批號：2044C520）；厚濾紙（美國Bio-rad公司，批號：1703932）；Millipore-PVDF膜（德國Merck公司，批號：IPVH00010）；封閉專用脫脂奶粉（北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1622）；雜交袋Western blotting專用（北京普利萊基因技術有限公司，批號：E1205）；預染色蛋白Marker（北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1103）；MilliporeECL超敏發光液（德國Merck公司，批號：WBKLS0100）。

2 實驗方法

2.1 DN KKAy小鼠模型的建立與分組

所有小鼠適應性喂養1周，自由進食飲水，KKAy小鼠進食KK鼠專用配合飼料；C57BL/6J小鼠進食普通飼料。誘導喂養10周后，尾靜脈采血測血糖，代謝籠收集小鼠24 h尿液，當隨機血糖＞16.7 mmol·L-1，24 h尿蛋白＞0.4 mg時確認為DN動物模型建立。造模成功的小鼠分層隨機分為模型組、厄貝沙坦組（每天25 mg·kg-1）與糖腎寧組（1.05 g·kg-1），正常對照組、模型組小鼠用等體積去離子水灌胃，灌胃劑量按10 mL·kg-1體重系數，用藥16周。

2.2 觀察指標

2.2.1 一般狀態

觀察小鼠的皮毛外觀、精神狀態、進食飲水情況、活動量等，每4周稱量體質量。

2.2.2 24 h尿蛋白定量測定

小鼠24 h尿液使用代謝籠收集，用BCA法檢測尿蛋白濃度，計算24 h尿蛋白含量，每4周檢測一次。

2.2.3 血液生化指標的檢測

股動脈取血，檢測血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）的含量。

2.2.4 腎組織病理學分析

干預16周后取材，無菌摘取腎臟，腎組織常規固定、石蠟包埋、切片，分別進行HE、Mallory染色。

2.2.5 原位雜交

取-20℃保存石蠟切片，復溫，Triton，H2O2-CH3OH，分別孵育10 min；復合消化液，6 min；37℃預雜交，2 h，37℃雜交5 h，SSC梯度沖洗，封閉液，37℃，30 min。生物素標記Digoxin，4℃過夜；高敏過氧化物酶親和素37℃，20 min，生物素化過氧化酶，37℃，20 min，DAB顯色15 min，蘇木素復染，返藍l0 min，樹膠封片。

2.2.6 原位雜交圖像分析

應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，棕黃色顆粒為陽性表達，每組隨機選取8-12個視野，測定OD值。

2.2.7 Western blotting

小鼠腎組織勻漿后加如RIPA裂解液裂解組織，取上清蛋白。BCA法測蛋白濃度，加上樣緩沖液沸水浴5 min進行蛋白變性，制膠、蛋白上樣，凝膠電泳、恒壓電轉，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBS（TBS-T）沖洗后，分別加Jagged（1∶1000）、Notch1（1∶2000）、Hes1（1∶500）、snail1（1∶1000），α-SMA（1∶2000）；E-Cad（1∶1000），4℃過夜。加1∶3000羊抗兔及1∶6000羊抗鼠二抗，室溫搖床反應1 h，滴加ECL化學發光液顯影。應用BIO-RAD曝光成像系統拍照，用Image J圖像分析軟件，進行圖像分析，與內參β-actin蛋白條帶進行對照，計算靶蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度的比值作為靶蛋白表達的相對水平。

2.2.8 統計分析

SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，數據用（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析進行比較，P＜0.05認為有統計學差異，P＜0.01認為有顯著性統計學差異。

3 實驗結果

3.1 一般狀態

通過連續無間斷的喂養KKAy小鼠KK專用飼料后，糖尿病腎病KKAy小鼠出現精神萎靡，活動量明顯減少，皮毛失去光澤，毛色暗淡，進食飲水量較C57/6J小鼠明顯增大，同時增多的也包括24 h尿量。飼養大約10周時，皮膚潰瘍和尿路感染等糖尿病并發癥出現。相對于模型組小鼠，厄貝沙坦及糖腎寧組小鼠的一般狀況有所改善。

圖1 糖腎寧對DN KKAy小鼠體質量的影響（xˉ±s,n=8）

圖2 糖腎寧對DN KKAy小鼠24 h尿蛋白定量的影響/mg（xˉ±s,n=7）

3.2 糖腎寧對DN小鼠體質量的影響

在本次實驗中，每四周小鼠稱重一次。如表1所示，隨著實驗進行，糖尿病腎病KKAy小鼠的體重逐漸增加，DN小鼠和C57BL/6J小鼠體重之間出現顯著差異（P＜0.01）。表中可以看到盡管治療組小鼠體重也隨時間延長緩慢增加，但從第14周起，各用藥組小鼠體重與模型組相比體質量下降，第18周起，與模型組相比，厄貝沙坦組、糖腎寧組體重有顯著統計學差異（P＜0.01）。

3.3 糖腎寧對DN小鼠24 h尿蛋白定量的影響

每4周測24 h尿蛋白定量（表2）。模型組小鼠24 h尿蛋白定量隨著時間的推移逐漸增加，且明顯高于正常組小鼠（P＜0.01），第十四周與模型組相比，糖腎寧組24 h尿蛋白明顯降低（P＜0.01）。雖然在第18周、第22周尿蛋白有少量增加，但糖腎寧組小鼠平均尿蛋白明顯低于模型組小鼠（P＜0.01），增長率與模型組相比明顯下降（表2）。

表1 糖腎寧對DN KKAy小鼠體質量的影響/g（xˉ±s,n=8）

表2 糖腎寧對DN KKAy小鼠24h尿蛋白定量的影響/mg（xˉ±s,n=7）

表3 糖腎寧對DN KKAy小鼠血清BUN、Scr的影響（xˉ±s）

3.4 糖腎寧對DN小鼠血清BUN、Scr含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清BUN、Scr含量顯著升高（P＜0.01），與模型組比較，糖腎寧組、厄貝沙坦組BUN、Scr含量顯著性降低（P＜0.01）。各治療組之間比較，糖腎寧組與厄貝沙坦組比較無統計學差異（表3）。

3.5 糖腎寧對DN大鼠腎組織病理形態的影響

在實驗結束時收集腎組織用于HE和Mallory染色。HE染色顯示正常組腎小球和腎小管及間質結構正常。在模型組中，可以看到腎臟組織存在糖尿病腎病特征性病理改變，如腎小球肥大、腎小球系膜細胞及基質重度增生，腎小球基底膜增厚，可以看都有腎小球結節硬化，腎間質大量炎癥細胞浸潤，部分腎小管萎縮等，可看到透明管型。糖腎寧及厄貝沙坦組的的這些病理改變在一定程度上被逆轉（圖3）。

Mallory染色顯示C57BL/6J小鼠中的腎小球及腎小管結構正常，無明顯纖維樣物質沉積，而在模型組小鼠腎組織中能明顯看到到腎小球硬化和腎小管間質纖維化，腎組織中有大量的藍色膠原纖維。然而，經過糖腎寧16周的治療后，在一定程度上逆轉了這些變化，小球硬化及小管間質纖維化明顯改善，膠原纖維膠模型組明顯減少（圖4）。

3.6 糖腎寧對腎組織Jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA和E-Cad mRNA表達的影響

由表4、5和圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10可得，E-cad mRNA在正常組中可見大量表達，Jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA mRNA指標表達較少，與正常組相比，模型組小鼠Jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA指標原位雜交圖片中能看到明顯的大量棕黃色顆粒在腎組織中沉積，Jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA的mRNA表達增加（P＜0.01），E-cad沉積明顯減少，E-cad指標的mRNA表達是明顯降低（P＜0.01），與模型組相比，厄貝沙坦組及糖腎寧組KKAy小鼠Jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA的mRNA表達顯著降低（P＜0.01）。E-cad mRNA的表達水平明顯升高（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠腎組織HE染色（HE×400）

圖4 各組小鼠腎組織Mallory染色（Mallory×400）

表4 原位雜交檢測糖腎平對DN KKAy小鼠腎組織Jagged1、Notch1、hes1、snail1 mRNA表達的影響（OD，xˉ±s,n=3）

3.7 糖腎寧對腎組織Jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA和E-Cad蛋白表達的影響

Western blotting顯示與正常組相比，DN KKAy小鼠腎組織中E-cad的蛋白表達是明顯降低的（P＜0.01），而Jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA蛋白表達增加（P＜0.01）。與模型組相比，經過16周灌胃治療，厄貝沙坦組、糖腎寧組KKAy小鼠腎組織中Jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA蛋白表達顯著降低（P＜0.01），E-cad蛋白表達明顯升高（圖5），提示糖腎寧能抑制糖尿病KKAy小鼠腎組織中Notch/snail1信號通路以及腎小管上皮細胞轉分化（表6、表7和圖11）。

表5 原位雜交檢測糖腎平對DN KKAy小鼠腎組織E-Cad、α-SMA mRNA表達的影響（OD，xˉ±s,n=3）

圖5 糖腎寧對E-Cad指標mRNA表達的影響

圖6 糖腎寧對α-SMA指標mRNA表達的影響

圖7 糖腎寧對Jagged1指標mRNA表達的影響

圖8 糖腎寧對Notch1指標mRNA表達的影響

圖9 糖腎寧對hes1指標mRNA表達的影響

圖10 糖腎寧對snail1指標mRNA表達的影響

表6 Western blotting檢測糖腎平對DN KKAy小鼠腎組織Jagged1、Notch1、hes1、snail1、蛋白表達的影響（灰度值，xˉ±s,n=3）

3 討論

由于生活方式和飲食結構的變化，DM的發病率逐年上升。目前，約7%的中國成年人是DM患者，數量高達92億[7]。10-20年糖尿病患者中，約1/3患者發生DN[8]。中國DN患病率上升，中老年人占絕大部分，患者組有傾向成為年輕人。DN仍然是慢性腎功能衰竭的主要原因之一，其治療比一般腎臟疾病復雜得多，預后差。腎間質性纖維化是慢性腎病進展為終末期腎功能衰竭的主要病理變化。有研究發現，超過1/3的間質成纖維細胞源自腎小管上皮細胞的上皮間質轉化（EMT），這可能是導致腎間質發生纖維化的最重要機制之一。因此抑制腎小管上皮細胞分化是延緩DN進展的重要作用靶點。腎小管上皮細胞EMT是DN的腎纖維化過程中獨特的事件，是DN腎損傷的關鍵因素，腎小管上皮EMT在一定條件下是可逆的，近年來已成為DN研究的熱點，具有較高的研究價值[9]。

在本實驗中，將KKay小鼠用作動物模型，通過用KK小鼠飼料連續喂養KKAy小鼠建立DN模型。該模型有很多優點，包括個體差異小，成型時間短，可操作性強，重復性好。導致其發病機制的多種因素與人類2型DM相似，并能模擬人類飲食和生活方式。國內外研究表明，高脂肪飲食8周后，KKAy小鼠血糖和24h尿蛋白排泄率均升高，腎臟重量和體重明顯大于對照組[10]。在此基礎上我們延長了KKAy小鼠的DM過程，使得該模型更加類似于人類DN過程。與正常組相比，模型組小鼠體重，腎重體重比，血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）顯著升高，24 h尿蛋白排泄隨時間逐漸增加。HE染色顯示，模型組病理結果檢測到腎臟形態變化，包括腎小球肥大，腎小球膜細胞增殖，腎小管上皮細胞液泡變性，腎間質炎癥細胞浸潤。Mallory染色顯示模型組有腎小球硬化和腎間質纖維化。在腎小球和腎小管間質中可以發現大量的膠原纖維。綜上所述，DN KKAy小鼠模型完全成功，本實驗成功復制了DN腎間質纖維化模型。

目前，現代醫學對DN及其并發癥治療方式基本為對癥治療，主要手段調節血糖，血脂和血壓，改善微循環以控制疾病。療效并不理想。在中國，中醫藥長期以來廣泛應用于糖尿病及其并發癥的治療[11]。因為其較低的毒性和副作用中醫藥在預防糖尿病并發癥方面具有相當優勢[12-14]。Xiao等[15]回顧了2 000余篇論文，證明中草藥是降低DN患者尿蛋白的有效安全方法。中藥治療DN具有一定的優勢，對進一步研究DN的預防和治療機制具有重要意義。

趙宗江教授鉆研大量文獻古籍，結合自身多年治療糖尿病腎病臨床經驗，提出糖尿病腎病“腎痿”假說，假說的核心病機概念是糖尿病日久遷延不愈，耗傷正氣，陰精虧虛，正虛則邪戀，痰、郁、熱、瘀等實邪互相膠結，積聚于腎臟。在腎臟功能上痰熱灼傷腎之絡脈，絡脈不通，血溢于脈外，可見血尿；濕熱之邪瘀于體內，阻礙氣血運行，日久氣虛更甚，失去固攝精微能力，便出現蛋白尿。毒與虛并存于腎，最終導致腎痿廢不用；病理形態上早期邪氣稽留，腎臟瘀阻或瘀塞，瘀血與濁毒凝聚癥瘕聚集，癥瘕積聚腎臟增大，中晚期癥瘕日久，腎功能喪失荒廢，痿縮廢用，腎小球硬化腎間質纖維化。不難看出其中核心的核心是久病遷延不愈，過程是有害物質積累，發展結果是慢性腎功能不全，腎小球硬化，腎間質纖維化。糖腎寧既是在“腎痿”假說指導下誕生的治療糖尿病腎病的復方，糖腎寧膠囊由熟地黃、山萸肉、懷山藥、杜仲、炒白芍、淫羊霍、水蛭、酒軍組成，方中熟地黃、山萸肉、懷山藥滋陰補腎，淫羊霍、杜仲溫腎助陽，炒白芍健脾補虛柔肝，水蛭、酒軍活血化瘀解毒利水。糖尿病腎病久病，病位在脾、在腎，糖腎寧補腎同時不忘固脾，補虛同時不棄攻實，全方一方面補陽滋陰，另一方面活血化瘀，利水解毒，攻補兼施，標本兼治，適用于陰陽兩虛證、淤毒內阻糖尿病腎病。糖腎寧不僅在臨床上取得了較好療效，前期實驗研究也證實[16]，糖腎寧對DN大鼠有腎臟保護功能，通過抑制TGF-β1和NF-κB表達、提高Smad7表達改善DN大鼠糖尿病腎病癥狀，延緩進展。并通過調控TGF-β1-smad2/3-ILK信號轉導通路，干預足細胞轉分化，維持足細胞形態功能的穩定性，從而保障腎小球濾過屏障的功能，減輕糖尿病腎病腎小球硬化和腎間質纖維化，保護DN腎功能，延緩其病程進展[17]。在本研究中，從代謝生化參數和形態學變化證據表明，糖腎寧有利于DN KKAy小鼠腎功能的恢復。減少尿24 h蛋白排泄，下調尿素氮和肌酐水平也。并且證實糖腎寧能夠抑制腎小管上皮EMT和腎間質纖維化。

表7 Western blotting檢測糖腎平對DN KKAy小鼠腎組織ECad、α-SMA蛋白表達的影響（灰度值，xˉ±s,n=3）

圖11 各組小鼠Western blotting結果

Notch信號通路廣泛參與身體多種疾病，包括多數腎臟病，腎小球疾病相關疾病包括腎小球硬化，也有notch信號通路的參與。并且notch信號轉導通路激活后還能參與細胞的增殖和凋亡過程。Murea等人[18]發現。Notch通路激活是蛋白尿性腎臟疾病一種常見機制廣泛存在腎小球硬化與腎小管間質纖維化病理生理過程中。Walsh等發現Jagged1，Hes1在糖尿病腎病患者腎小管間質表達與對照組相比明顯增加[19]。不僅如此，近年來大量的基礎及臨床實驗Notch信號通路在EMT過程中發揮重要作用。Zhicheng Xiao等發現在上皮細胞中的Notch通路的激活可以促進成纖維細胞的增殖和分化，CKD及腎間質纖維化患者腎組織中Notch信號通路表達明顯增高，Notch信號通路是獨立誘導EMT的[20,21]。DN細胞外基質增生，最終促進腎小管間質纖維化發展與Notch信號通路在糖尿病腎病的重新激活有關，這個概念的進一步支持來自于應用Notch信號通路抑制劑可以改善DN腎小管間質纖維化并抑制抑制進展的事實。

Snail鋅指轉錄基因家族是被廣泛認可的E-Cad蛋白表達的抑制基因，其通過多種方式參與上皮細胞的EMT，它不僅能夠抑制E-Cad的表達，其他一些上皮標志物諸如緊密連接蛋白、封閉蛋白、細胞角蛋白也能被其抑制，同時還能增強間質成纖維細胞標志物α-SMA的表達，已證實snail信號通路參與介導損傷修復所致肺泡上皮Ⅱ型EMT的過程[22，23]，人腎組織活檢中發現纖維化的發生與snail高表達相關，苯氧胺誘導的snail轉基因小鼠高表達snail基因，會誘發Ⅱ型EMT并最終導致腎纖維化。我們實驗證實Notch/ snail1信號轉導通路在糖尿病腎病KKAy小鼠腎組織中是激活的，Jagged1、Notch1、hes1、snail1、α-SMA蛋白及mRNA表達均升高，糖腎寧干預后Notch信號通路的各成分蛋白及mRNA表達被被明顯抑制并伴有腎小管上皮轉分化腎間質纖維化的明顯改善，這一結果充分說明糖腎寧可能通過干預Notch/snail1信號轉導通路抑制糖尿病腎病腎小管上皮轉分化腎間質纖維化。

總之，本次試驗證實糖腎寧可以改善糖尿病癥狀，抑制糖尿病腎病腎小管上皮EMT，減少腎間質纖維化，延緩DN進展。抑制DN KKAy小鼠腎組織中Notch/snail1信號轉導通路的表達。并且糖腎平對DN KKAy小鼠腎臟保護作用及延緩腎間質纖維化可能是通過干預Notch/snail1信號轉導通路實現。

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Renoprotective Effect of Tang-Shen-Ning and Its Influence on Notch/Snail1 Pathway in Diabetic Nephropathy KKAy Mice

Yang Guannan,Zhao Zongjiang,Zhang Xinxue,Yang Meijuan
(School of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

This paper was aimed to study the renal protective effect of Tang-Shen-Ning(TSN)on diabetic nephropathy (DN)KKAy mice by inhibiting the Notch/snail1 signal transduction pathway.A total of 30 KKAy mice,which were fed with mice-dedicated food for 10 weeks and with the blood glucose over 16.7 mmol·L-1,24-hour urinary albumin larger than 0.4 mg,were made into the DN model.The DN mice were randomly divided into the model group,irbesartan group and TSN group according to their blood glucose and weight.Intragastric administration of medication was given.A total of 10 female C57BL/6J mice were selected as the control group.The general condition,body weight and 24-hour urinary protein quantitation were detected.After 16-week intervention,mice were sacrificed.Levels of blood glucose,blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(Scr)were detected.HE and Mallory staining were applied to renal tissues.In situ hybridization(ISH)and western blotting were used to detect the Notch/snail1 pathway,α-SMA,E-Cadherin protein and mRNA expression in renal tissues.Statistical analysis was made by SPSS20.0 software.The results showed that compared with the model group,the rats’general conditions were improved;body weight and 24-hour urinary protein quantitation were significantly decreased(P＜0.01);contents of BUN and Scr were reduced(P＜0.01,P＜0.05).The pathological staining showed significantly reduction on renal interstitial fibrosis.The Notch/snail1 pathway,protein and mRNA expression of α-SMA were significant reduced with statistical significance(P＜0.01);protein and mRNA expression of ECad protein were significant increased with statistical significance(P＜0.01).It was concluded that TSN can protect the renal function of DN,delay the disease progression of DN,and inhibit epithelial-mesenchymal transdifferentiation(EMT) of renal tubular epithelial cells and renal interstitial fibrosis.Furthermore,the inhibition on EMT may be through the regulation of the Notch/snail1 pathway.

Diabetic nephropathy,Tangshenning，consumptive kidney disease,KKAy mice,epithelial-mesenchymal transdifferentiation of renal tubular epithelial cells,Notch/snail1 pathway

10.11842/wst.2017.06.027

R285.5

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：王晶）

2017-04-28

修回日期：2017-05-20

＊國家自然科學基金面上項目（81373831）：基于“腎痿”組方糖腎平干預糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉分化的分子機制研究，負責人：趙宗江。

＊＊通訊作者：趙宗江，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫藥防治糖尿病腎病的機制研究。