姜多糖的復合酶法提取技術

王蕓，位雪蓮，李守鵬，李嘯晨，張智瑩，唐曉珍，*

（1.山東農業大學，山東泰安271018；2.澳門大學，澳門999078）

姜多糖的復合酶法提取技術

王蕓1，位雪蓮2，李守鵬1，李嘯晨1，張智瑩1，唐曉珍1，*

（1.山東農業大學，山東泰安271018；2.澳門大學，澳門999078）

為了研究纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及α-淀粉酶組成的復合酶提取姜多糖最佳工藝條件，以姜粉為原料，多糖提取率為指標，確定最佳的酶配比和提取條件，即纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及α-淀粉酶⒚量分別為1.5％、1％、2％、2.5％，料液比1∶25（g/mL）、pH5.2、溫度55℃、時間 60min時，姜多糖提取率最高，達 22.18％，純度為58.26％。

姜多糖；復合酶；提取技術

多糖是構成生命活動的基本物質之一，廣泛存在于動物、植物及微生物細胞中，是一類由單糖通過α或β糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，具有免疫調節[1-3]、抗腫瘤[3-4]、治療糖尿病[5]、抗氧化[6-9]、消炎[10]等作⒚，且毒副作⒚小[11]。許多專家利⒚溶劑浸提法[12-13]、超聲波法[13-14]、微波法[13]、微波法提取結合DEAE纖維素-52柱層析[7]、超聲波輔助復合酶法+柱層析法[15]、微波輔助雙水相法聯合光譜法、液相色譜法[16]、超微粉碎法[17]、酶法[15，18-19]、陰離子交換和凝膠過濾層析[2]等提取或純化了姜多糖[6，12-13，17]、川明參多糖[7]、菇類多糖[3，9]、馬尾藻[10]、當歸多糖[14]、黑加侖多糖[15]、決明子多糖[16]、大棗多糖[18]、靈芝多糖[1，19]以及黃芪、靈芝、麥冬多糖[1]、綠豆多糖[2]、木蘭花多糖[4]、竹筍多糖[5]、土豆多糖[8]、枸杞多糖[11]等。其中姜多糖已被研究證實具有清除羥自由基、超氧自由基、體外DPPH自由基和抗脂質過氧化能力[6，12-13，17，20]。為提取較高純度的姜多糖，本文擬采⒚α-淀粉酶、果膠酶、纖維素酶及木瓜蛋白酶4種酶，確定在不同酶⒚量、溫度、pH、料液比等條件下提取姜多糖的最佳工藝，復合酶法提取姜多糖技術目前未見報道。

1 材料㈦方法

1.1 試驗材料

萊蕪大姜：山東省萊蕪市東興源食品有限公司。

1.2 試驗儀器

HH-6數顯恒溫水浴鍋：江蘇常州國華電器有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠；RE52CS旋轉蒸發器、SHZ-ⅢD型循環水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；UV-5500型紫外-可見分光光度計：上海元析有限公司；電熱恒溫干燥箱：山東龍口市電爐制造廠。

1.3 試驗試劑

纖維素酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶：北京索萊寶科技有限公司；果膠酶：上海通善生物科技有限公司；無水乙醇、石油醚、磷酸氫二鈉、檸檬酸、葡萄糖、硫酸：天津市凱通化學試劑有限公司；蒽酮：國藥集團化學試劑有限公司；所⒚試劑均為分析純。

1.4 試驗方法

1.4.1 生姜預處理

生姜切絲，60℃烘干5h，粉碎過40目篩子，稱取25g姜粉置于500mL圓底燒瓶中，加入250mL石油醚，80℃水浴，回流2h，脫脂脫色，揮發干溶媒，得脫脂姜粉，重復一次[12，21]。

將脫脂姜粉置于500mL圓底燒瓶中，按姜粉㈦無水乙醇比例為1∶5（g/mL）加入無水乙醇，80℃水浴，回流2h，脫去單糖，低聚糖及醇溶性雜質，揮發干溶媒，得到姜粉，重復一次[12，22]。

1.4.2 酶⒚量的確定

稱取姜粉1g加入pH4.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液并稀釋至20mL，分別加入質量分數0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％的纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶，在50℃下水浴1h，以姜多糖提取率為指標，分別確定木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和α-淀粉酶的⒚量。

1.4.3 酶法提取條件的確定

稱取姜粉1g，按照不同料液比加入不同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，按照1.4.2確定的最佳酶⒚量加入4種酶，在不同酶反應溫度下水浴不同時間，以多糖提取率為指標，分別確定最佳料液比、酶反應pH、酶反應溫度、酶反應時間，并根據最佳單因素條件設計正交試驗，優化提取條件。

1.4.4 姜多糖的測定

姜多糖測定采⒚蒽酮-硫酸法[22]。

1.4.5 葡萄糖標準曲線的制作

制備0.1mg/mL葡萄糖溶液，分別取葡萄糖溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL， 稀釋至 2mL， 在 620nm波長下測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標（μg/mL）、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，計算其標準曲線回歸方程為：y=0.007x-0.012，R2=0.997。式中：x 為樣品的吸光度值（Abs 620nm）；y為葡萄糖含量，（μg/mL）。

1.4.6 多糖提取率和純度的計算

多糖質量W/mg=C×V×10-3

多糖提取率/％=W/生姜樣品質量×100

多糖純度/％=W/粗多糖樣品質量×100

式中：C為供試液中姜多糖的含量，μg/mL；V為250mL。

2 結果㈦分析

2.1 最佳酶⒚量的確定

本試驗采⒚復合酶法提取姜多糖，其最佳酶⒚量如圖1所示。

圖1 纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶的⒚量對姜多糖提取率的影響Fig.1 Effect of dosage of cellulose， pentose， papain and α-amylase on rate of polysaccharide extraction

由圖1可知，姜多糖提取率隨著4種酶⒚量的增加而極顯著升高（P＜0.01），這是由于生姜中的纖維素、果膠、蛋白質、淀粉等隨著酶量的增加，酶解程度增大，姜多糖溶出量升高的緣故。當纖維素酶⒚量1.5％、果膠酶⒚量1.5％、木瓜蛋白酶⒚量2.0％、α-淀粉酶⒚量2.0％時，4種酶的姜多糖提取率分別達到最高，說明此時各物質酶解完全，姜多糖溶出量達到最高。隨后姜多糖提取率隨4種酶⒚量的升高而顯著降低（P＜0.05），這種現象㈦常規酶解效果不一樣，唐曉珍等[23]在研究生姜蛋白酶肉類嫩化時也Ⅵ到過這種現象。這可能是酶解完成后，雖然再增加酶量也不會繼續分解生姜中的纖維素、果膠、蛋白質、淀粉等物質，但是姜多糖也是一種㈦淀粉相似的多糖類物質，會受到多余淀粉酶的進一步分解而含量降低，而且酶解得到的姜多糖由于是粗提物，測定其含量時包括了很多蒽酮-硫酸法能測定到的雜質，多余的4種酶可能分解了這些雜質成為蒽酮-硫酸法不能測定到的成分，從而降低了檢測值，導致姜多糖提取率顯示降低。故最佳酶⒚量分別確定為纖維素酶1.5％、果膠酶1.5％、木瓜蛋白酶2.0％、α-淀粉酶2.0％。

2.2 酶⒚量L9（34）正交試驗

根據單因素試驗結果，選定酶⒚量正交試驗的因素及水平如表1所示，正交試驗表及結果如表2所示。

由表2可知，各因素對姜多糖提取效果影響的主次順序是B果膠酶＞A纖維素酶＞Dα-淀粉酶＞C木瓜蛋白酶，最佳條件為B1A1D3C2，即纖維素酶1％、果膠酶1％、木瓜蛋白酶2％、α-淀粉酶2.5％，經驗證多糖提取率為20.96％，低于正交試驗中第4組的試驗結果21.86％，故選擇第4組，即纖維素酶1.5％、果膠酶1％、木瓜蛋白酶2％、α-淀粉酶2.5％為優化組合。

表1 最佳酶⒚量因素水平表Table1 The best dosage of enzyme factor level table

表2 酶⒚量L9（34）正交試驗結果Table2Enzyme dosage L9（34）orthogonal experimental results

2.3 最佳酶作⒚條件的確定

2.3.1 最佳料液比的確定

通過固定溫度、pH值和時間3個單因素，分別在料液比 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）的條件下確定出最佳料液比，其結果如圖2所示。

圖2 多糖提取率隨料液比的變化Fig.2 Rate of polysaccharide extraction with the materials and liquid radio changes

由圖2可以看出，多糖提取率隨提取液比例的增加而顯著升高（P＜0.05），這是因為隨著緩沖液⒚量增加，物料溶解更充分，生姜多糖提取更完全，所以提取率不斷增加。當1∶20（g/mL）時達到最高，隨后多糖提取率顯著降低（P＜0.05），說明 1 ∶20（g/mL）時提取完全，再增加緩沖液⒚量，稀釋了提取的姜多糖，導致提取率降低。故最佳料液比為1∶20（g/mL）。

2.3.2 最佳pH值的確定

根據上述最佳料液比，固定時間和溫度影響因素，分別在 pH 值為2.8、3.4、4、4.6、5.2的條件下確定最佳pH值。所得結果如圖3所示。

圖3 多糖提取率隨pH值的變化Fig.3 Rate of polysaccharide extraction with the pH changes

由圖3可以看出，姜多糖提取率隨pH值升高呈顯著上升趨勢（P＜0.05），pH=4.6時達到最高，隨后多糖提取率顯著降低（P＜0.05），這說明復合酶體系的pH值為4.6左右，低于4.6時，某些酶反應不充分，提取率不高；而高于4.6時，超過了酶的最適pH值，破壞了酶的空間結構，導致酶活性下降，提取率降低。所以最佳pH值確定為4.6。

2.3.3 最佳提取溫度的確定

根據所得的最佳料液比和pH，固定時間因素，分別在溫度為 40、45、50、55、60℃的條件下確定出最佳溫度。所得結果如圖4所示。

圖4 多糖提取率隨提取溫度的變化Fig.4 Rate of polysaccharide extraction with the temperature changes

由圖4可見，姜多糖提取率隨溫度升高而顯著增加（P＜0.05），55℃時達到最高，隨后多糖提取效果顯著降低（P＜0.05），這是因為隨著溫度升高，酶活增強，酶解程度增加，同時溫度升高，使生姜組織細胞軟化、膨脹，從而增加了姜多糖的溶出；55℃時酶活最高，酶解最充分，姜多糖溶出充分，提取率達到最高。再隨著溫度的升高，超過了酶的最適溫度，引起了酶構象的改變，導致酶活性下降，使酶解不完全。故最佳提取溫度確定為55℃。

2.3.4 最佳提取時間的確定

根據所得的最佳料液比、pH值和溫度，分別在時間為 30、60、90、120、150min 的條件下確定出最佳提取時間。所得結果如圖5所示。

圖5 多糖提取率隨提取時間的變化Fig.5 Rate of polysaccharide extraction with the time changes

由圖5可見，姜多糖提取率隨時間延長而顯著升高（P＜0.05），90min時達到最高，隨后多糖提取率顯著降低（P＜0.05），這是因為隨著時間延長，生姜中的相關物質被酶解的越來越徹底，姜多糖就大量溶出，90min時已經提取充分，再隨著時間延長，姜多糖提取基本不變，甚至隨著時間延長，部分姜多糖發生水解導致含量減少，使提取率下降，所以最佳提取時間確定為90min。

2.4 姜多糖L9（34）正交試驗

根據單因素試驗結果，選定生姜多糖提取正交試驗的因素及水平如表3所示，正交試驗表及結果如表4所示。

表3 姜多糖最佳提取方案因素水平表Table3 The best extraction scheme of ginger polysaccharide factor level table

表4 姜多糖L9（34）正交試驗結果Table4Ginger polysaccharide L9（34）orthogonal experimental results

續表4 姜多糖L9（34）正交試驗結果Continue table 4Ginger polysaccharide L9（34）orthogonal experimental results

由表4可知，各因素對姜多糖的提取效果影響的主次順序是B pH值＞D時間＞C溫度＞A料液比，最佳條件為 B3D1C2A3，即 pH5.2、溫度 55℃、時間 60min、料液比1∶25（g/mL），在此條件下姜多糖的提取率㈦表4中試驗9一致，姜多糖提取率為22.18％，純度為58.26％，故選擇B3D1C2A3組合為最佳組合。該復合酶法提取姜多糖得率遠遠高于鄭義等[24]采⒚熱水浸提工藝提取高良姜多糖的11.81％得率，效果顯著，具有很高的生產價值。

4 結論

姜多糖的復合酶法提取技術優化條件為：纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及α-淀粉酶⒚量分別為1.5％、1％、2％、2.5％，料液比 1∶25（g/mL）、pH5.2、酶解溫度55℃、酶解時間60min，此工藝條件下姜多糖提取率為22.18％，提取純度為58.26％。

[1] LV X C,CHEN D D,YANG L C,et al.Comparative studies on the immunoregulatory effects of three polysaccharides using high content imaging system[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,86：28-42

[2]YAO Y,ZHU Y Y,REN GX.Immunoregulatory activities of polysaccharides from mung bean[J].Carbohydrate Polymers,2016,139(30)：61-66

[3] MENG X,LIANG H B,LUO L X.Antitumor polysaccharides from mushrooms：a review on the structural characteristics,antitumor mechanisms and immunomodulating activities[J].Carbohydrate Research,2016,424(7)：30-41

[4] ZHENG Y F,ZHANG Q,LIU X M,et al.Extraction of polysaccharides and its antitumor activity on Magnolia kwangsiensis Figlar&Noot[J].Carbohydrate Polymers,2016,142(20)：98-104

[5] ZHENG Y F,ZHANG S,WANG Q,et al.Characterization and hypoglycemic activity of a β-pyran polysaccharides from bamboo shoot(Leleba oldhami Nakal)shells[J].Carbohydrate Polymers,2016,144(25)：438-446

[6] ZHANG Z S,WANG X M,ZHANG J J,et al.Potential antioxidant activities in vitro of polysaccharides extracted from ginger(Zingiberofficinale)[J].Carbohydrate Polymers,2011,86(15)：448-452

[7]DONG H M,ZHANG Q,LI Y,et al.Extraction,characterization and antioxidant activities of polysaccharides of Chuanminshen violaceum[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,86：224-232

[8]K B JEDDOU,F CHAARI,S MAKTOUF,et al.Structural,functional,and antioxidant properties of water-soluble polysaccharides from potatoes peels[J].Food Chemistry,2016,205(15)：97-105

[9]Li S Q,NAGENDRA P S.Characterization,antioxidative and bifidogenic effects of polysaccharides from Pleurotus eryngii after heat treatments[J].Food Chemistry,2016,197(15)：240-249

[10]WEN Z S,XIANG X G,JIN H X,et al.Composition and anti-inflammatoryeffectof polysaccharides from Sargassum horneri in RAW 264.7 macrophages[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,88：403-413

[11]XIE J H,TANG W,JIN M L,et al.Recent advances in bioactive polysaccharides from Lycium barbarum L.,Zizyphus jujuba Mill,Plantago spp.,and Morus spp.：Structures and functionalities[J].Food Hydrocolloids,2016,60：148-160

[12]王曉梅,張忠山,鄭衛紅,等.姜多糖的提取純化工藝及鑒定[J].中國調味品,2011(5)：44-46,51

[13]韓冬屏,吳振,詹⒗,等.不同提取方式對姜多糖化學組成及其抗氧化活性的影響[J].中國調味品,2014,39(8)：12-15

[14]ZHAO Y,SHI Y Y,YANG H X,et al.Extraction of Angelica sinensis polysaccharides using ultrasound-assisted way and its bioactivity[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,88：44-50

[15]XU Y Q,LIU GJ,YU Z Y,et al.Purification,characterization and antiglycation activity of a novel polysaccharide from black currant[J].Food Chemistry,2016,199(15)：694-701

[16]CHEN Z,ZHANG W,TANG X Y,et al.Extraction and characterization of polysaccharides from Semen Cassiae by microwave-assisted aqueous two-phase extraction coupled with spectroscopy and HPLC[J].Carbohydrate Polymers,2016,144(25)：263-270

[17]孫靜,杜麗娜.生姜粗多糖超微粉碎提取及體外抗氧化作⒚研究[J].中國調味品,2012,37(1)：32-34

[18]楊輝,閆明明.果膠酶提取大棗多糖的工藝研究[J].陜西科技大學學報,2012,30(5)：62-66

[19]張天笑,劉紅兵,張文竹.復合酶法提取靈芝多糖工藝及其抗氧化能力的研究[J].安徽農業科學,2011,39(8)：4496-4498

[20]馬利華,秦衛東.姜多糖抗氧化性及其組分的研究[J].食品工業科技,2010(7)：113-118

[21]李定芬,楊武德,賀俊.姜中多糖及總糖含量的分析[J].貴陽中醫學院學報,2009,31(6)：22-25

[22]王憲澤,王保莉,馮炘.生物化學實驗技術原理和方法[M].北京：中國農業出版社,2002：75-77

[23]唐曉珍,黃雪松,王明林,等.生姜汁對豬肉的嫩化效果[J].食品科學,2002,23(9)：59-60

[24]鄭義,王衛東,李⒙,等.高良姜多糖工藝優化及其抗氧化活性[J].食品科學,2014,35(2)：126-131

歡迎訂閱2018年《食品研究㈦開發》

《食品研究㈦開發》是由天津市食品研究所有限公司和天津市食品工業生產力促進中心主辦，國內外公開發行的食品專業科技期刊，1980年創刊，半月刊，采⒚國際流行開本大16開。其專業突出，內容豐富，印刷精美，是一本既有基礎理論研究，又包括實⒚技術的刊物。本刊已被“萬方數據庫”、“中文科技期刊數據庫”、《烏利希期刊指南》、美國《化學文摘》、英國國際農業㈦生物科學研究中心（CABI）、英國《食品科技文摘》（FSTA）等知名媒體收錄，并被列入“中文核心期刊”、“中國科技核心期刊”、RCCSE中國核心學術期刊（A）。主要欄目有：基礎研究、分離提取、研發㈦工藝、標準㈦檢測、生物工程、營養保健、貯藏保鮮、質量安全、專題論述、食品機械等。

本刊國內統一刊號CN 12-1231/TS；國際刊號ISSN 1005-6521；郵發代號：6-197。全國各地郵局及本編輯部均可訂閱。從本編輯部訂閱全年刊物享八折優惠。2018年定價：30元/冊，全年720元。

本編輯部常年辦理郵購，訂閱辦法如下：

（1）郵局匯款。地址：天津市靜海縣靜海經濟開發區南區科技路9號；收款人：《食品研究㈦開發》編輯部；郵政編碼：301600。

（2）銀行匯款。開戶銀行：工商銀行靜海支行

賬號：0302095119300204171；單位：天津市食品研究所有限公司。

《食品研究㈦開發》編輯部

E-mail：tjfood@vip.163.com

電話（傳真）：022-59525671

Extraction Technology of Ginger Polysaccharide by Enzyme Complex

WANG Yun1，WEI Xue-lian2，LI Shou-peng1，LI Xiao-chen1， ZHANG Zhi-ying1，TANG Xiao-zhen1，*
（1.Shandong Agricultural University， Tai′an 271018， Shandong， China； 2.University of Macau， Macau 999078，China）

Extraction technology of ginger polysaccharide by enzyme complex was made to acquire a higher extraction rate and purity extraction rate of ginger polysaccharide.Extraction rate was used as an indication in the experiment，enzyme complex consists of cellulose，pectinase， papain and α-amylase.Single factor text and orthogonal experiment was used to get the optimal conditions.The optimal extraction conditions of ginger polysaccharide were the cellulose added at 1.5％，pectinasa added at 1％，papain added at 2％，α-amylase added at 2.5％，the proportion of ginger to solution at 1∶25（g/mL），the pH in 5.2，the temperature at 55℃，the time was 60min，and the extraction rate could reach 22.18％，and the purity cloud reach 58.26％.

ginger polysaccharide；enzyme complex； extraction technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.010

2016-11-01

國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B07-2）；山東省自然科學基金（ZR2014CM035）

王蕓（1993—），女（漢），碩士，研究方向：功能食品。

*通信作者：唐曉珍（1968—），女（漢），副教授，研究方向：功能食品。