UPLC-MS/MS分析運動飲料中水溶性維生素

張欽

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，河南鄭州450046）

UPLC-MS/MS分析運動飲料中水溶性維生素

張欽

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，河南鄭州450046）

建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析運動飲料中 VB1、VB2、VB5、VB6、VB7、VB9、VB12、煙酸、煙酰胺、VC10 種水溶性維生素的方法。樣品前處理⒚10％乙醇沉淀提取后，采⒚Waters Atalantis T3色譜柱（2.1mm×150mm，3μm）分離，以0.1％甲酸-10.0％甲醇為流動相的梯度洗脫模式下，10種水溶性維生素在10.0ng/mL～1 000.0ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為 0.999 3～0.999 9，檢出限范圍為 0.10 μg/kg～11.5 μg/kg，定量限范圍為 0.35μg/kg～38.0 μg/kg，加標回收率為90.3％～99.5％，相對標準偏差（RSD）為2.0％～3.6％。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；運動飲料；水溶性維生素

運動飲料是根據(jù)人體運動的生理消耗而配置的，通過合理補充營養(yǎng)代謝物質(zhì)使運動員抗疲勞能力提高，優(yōu)化肌肉和肝糖原儲備來提高運動能力[1-2]。運動飲料中主要含有碳水化合物，電解質(zhì)，維生素，氨基酸等成分，能補充人體所需的營養(yǎng)成分，平衡新陳代謝。其中維生素是維持人體正常的物質(zhì)代謝和某些特殊生理功能不可缺少的一類低分子有機化合物，在人體生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作⒚[3-5]。在我國標準 GB 15266-2009《運動飲料》中[6]，僅針對 VC、硫胺素、核黃素這3種維生素作出了限量要求，其他維生素未作出限量要求，但是針對特殊人群的飲料，有必要了解其中的維生素的種類以及含量，以便保障人們科學、定量地攝入維生素。因此，急需建立一種方便可行、可同時檢測多種維生素的檢測方法以滿足實際工作需求。

目前對水溶性維生素的測定方法有微生物法、分光光度法以及高效液相色譜法等[6-15]，這些方法中一次只能對幾種維生素進行測定，測定時間長，耗材消耗多。本研究利⒚質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式的選擇性和特異性，結(jié)合運動飲品的基質(zhì)成分相對簡單，可簡化提取過程的特點，建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可同時對運動飲料中10種水溶性維生素進行測定，靈敏度高，線性范圍寬，極大地提高了檢測效率，在實驗室的推廣可行性較高，可為運動飲品中多種維生素營養(yǎng)同時定量提供技術(shù)支持和參考。

1 材料㈦方法

1.1 儀器㈦試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；API4000四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB公司。

標準品VB（1硫胺素）、VB（2核黃素）、VB（5泛酸）、VB6（吡哆醇）、VB（7生物素）、VB（9葉酸）、VB1（2氰鈷胺）、煙酸、煙酰胺、VC：美國Sigma公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）：美國Fisher Scientific公司。

1.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：WatersAtalantisT（32.1mm×150mm，3μm）；

流速：0.3mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30℃；

流動相A為0.1％甲酸水溶液，B為10.0％甲醇；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

1.3 試驗方法

1.3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采⒚針泵連續(xù)進樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，先對各個目標物進行母離子全掃描，然后對其子離子進行全掃描，分別選定定性離子和定量離子，并對噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進行優(yōu)化。

1.3.2 標準曲線的制作

1）VB1標準溶液：稱取 100.0mg 的 VB1標準品，加入5.0mL水使其完全溶解后⒚甲酸調(diào)節(jié)pH值至2.0后定容至10.0mL避光保存。

2）VB2標準溶液： 稱取 100.0mg的 VB2標準品，加入4.0mL水和1.0mL氨水使其完全溶解后定容至10.0mL避光保存。

3）VB5、VB6、VB12、煙酸、煙酰胺、VC標準溶液：各稱取100.0mg的標準品，加入水使其完全溶解后定容至10.0mL避光保存。

4）VB7、VB9標準溶液： 各稱取100.0mg的標準品，加入4.0mL水和1.0mL氨水使其完全溶解后⒚甲酸調(diào)節(jié)pH值至7.0后定容至10.0mL避光保存。

準確吸取上述10種維生素標準溶液，配成1mg/mL的標準貯備液，再稀釋成濃度為 10.0、20.0、40.0、100.0ng/mL的系列混合標準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)⒚。

1.3.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

運動飲料若直接上樣測定水溶性維生素，樣品中的干擾成分太多會影響測定，故要對運動飲料中的一些干擾基質(zhì)進行沉淀凈化。本試驗結(jié)合10種水溶性維生素都是水溶性物質(zhì)的特性以及樣品為運動飲料的特性，比較了亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）+乙酸鋅溶液（219g/L）混合液、10％甲醇、10％乙醇、10％乙腈等4種提取溶劑對10種目標物的提取效果。

1.3.4 加標回收試驗及樣品測定

以已知目標成分含量的運動飲料為基質(zhì)，加入10種水溶性維生素的標準混合溶液，選擇優(yōu)化后的前處理條件和儀器條件，上機檢測，計算回收率。

2 結(jié)果㈦討論

2.1 色譜柱的選擇

食品中水溶性維生素的檢測比較常⒚的色譜柱有C18柱和T3柱[16-18]。因此，本試驗比較了Waters BEH C1（82.1mm×150mm，3μm）和WatersAtalantisT（32.1mm×150mm，3μm）這2款不同的色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水溶性維生素大多以離子形態(tài)存在于溶液中，在C18柱上的保留能力較弱，目標物的總離子流圖的分析效果不理想（如圖1所示）；但是在T3柱分析柱上由于其特殊鍵合力，能㈦水溶性維生素形成氫鍵的結(jié)合力強弱不同，在分離時更具有優(yōu)勢，目標物的分離效果更好，所以本試驗選擇T3柱作為10種水溶性維生素的分析色譜柱（如圖2所示）。

2.2 流動相體系的影響

在選擇T3柱作為10種水溶性維生素的分析色譜柱的前提下，參考相關(guān)文獻[19-23]，本試驗對甲醇-水、甲醇-0.1％甲酸以及10％甲醇-0.1％甲酸3種流動相進行比較，分別對10種水溶性維生素的分析影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10％甲醇-0.1％甲酸作為流動相，10種水溶性維生素的分離效果最好，目標峰的分離度高，峰形尖銳，基線溫定。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采⒚針泵連續(xù)進樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，分別對濃度為100ng/mL的VB（1硫胺素）、VB（2核黃素）、VB（5泛酸）、VB（6吡哆醇）、VB（7生物素）、VB（9葉酸）、VB1（2氰鈷胺）、煙酸、煙酰胺、VC的標準溶液進行母離子全掃描，確定其分子離子，優(yōu)化各母離子的錐孔電壓。再在上述母離子的基礎(chǔ)上，對其子離子進行全掃描，選擇兩組豐度最高的離子，較高的作為定量離子，次之的為定性離子，并對噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進行優(yōu)化。

優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)為：噴霧電壓4 000 V、離子源溫度400℃、氮氣流量20 L/min、掃描停滯時間50 ms，其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

依照表2所設(shè)定質(zhì)譜的條件，以及超高效液相色譜的條件，選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple reaction monitoring model，MRM）進行檢測，10種水溶性維生素能在10min內(nèi)快速分離，10種目標物的MRM圖如圖3所示。

圖1 使⒚C18色譜柱10種維生素總離子流圖Fig.1 The total ion chromatograms of 10 kinds of water-soluble vitamins using the C18column

圖2 使⒚HSS T3色譜柱10種維生素總離子流圖Fig.2 The total ion chromatograms of 10 kinds of water-soluble vitamins using a HSS T3column

表2 10種水溶性維生素的多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Table2 Mass spectrometric parameters for 10 kinds of watersoluble vitamins

2.4 標準曲線的制作

為了驗證10種水溶性維生素在優(yōu)化好的儀器條件中的線性關(guān)系，配制了濃度為 10.0、20.0、40.0、100.0、1 000.0ng/mL的系列混合標準溶液上機進行檢測。試驗結(jié)果表明，10種水溶性維生素在10.0ng/mL～1 000.0ng/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.999），并得到10種目標組分的檢出限范圍為0.10 μg/kg～11.5 μg/kg，定量限范圍為 0.35 μg/kg～38.0 μg/kg，結(jié)果見表3。

2.5 提取溶劑的選擇

在對VB（1硫胺素）、VB（2核黃素）、VB（5泛酸）、VB6（吡哆醇）、VB（7生物素）、VB（9葉酸）、VB1（2氰鈷胺）、煙酸、煙酰胺、VC等10種目標物提取的過程中，目標成分易被破壞以及樣品中沉淀所吸附，所以在前處理過程中既要考慮要保護好目標成分也要避免目標物被沉淀所吸附。本試驗參考相關(guān)文獻[24-28]，結(jié)合10種水溶性維生素都是水溶性物質(zhì)的特性以及樣品為運動飲料的特性，比較了亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）+乙酸鋅溶液（219g/L）混合液、10％甲醇、10％乙醇、10％乙腈等4種提取溶劑對10種目標物的提取效果，見圖4。

續(xù)表2 10種水溶性維生素的多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Continue table 2 Mass spectrometric parameters for 10 kinds of water-soluble vitamins

圖3 10種水溶性維生素的MRM圖Fig.3 MRM chromatogram of 10 kinds of water-soluble vitamins

表3 10種水溶性維生素的保留時間、標準曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限㈦定量限Table3 Retention time， standard curve， correlation coefficient， detection limit and quantitative limit of 10 kinds of water-soluble vitamins

圖4 提取液對10種水溶性維生素平均回收率的影響Fig.4 The effect of extract solution on the average recovery rate for 10 kinds of water-soluble vitamins

結(jié)果如圖4所示，4種提取溶劑中，10％乙腈為提取溶劑時，運動飲料中的維生素回收率最高，其次為10％乙醇、10％甲醇；亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）+乙酸鋅溶液（219g/L）混合液為提取溶劑時，樣品中的基質(zhì)沉淀效果明顯，但是維生素的回收率不高，可能是混合液對運動飲料中的水溶性的維生素有破壞作⒚；其中10％乙醇提取率雖不及10％乙腈的提取效果好，但是考慮到乙腈的毒性比乙醇大，以及成本問題，所以本試驗還是選擇10％乙醇作為運動飲料的提取溶劑。

2.6 加標回收㈦相對偏差

在前處理條件㈦儀器條件下，利⒚已測定10種維生素含量的運動飲料進行加標回收率試驗，在分別添加0.05、0.1、1.0mg/kg 3個梯度濃度的標準混合溶液，每個濃度平行測定5次，測定結(jié)果見表4。

表4 方法的回收率及相對標準偏差（n=5）Table4 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表4可見，10種水溶性維生素的加標回收率為90.3％～99.5％，相對標準偏差（RSD）為2.0％～3.6％，表明本試驗所建立的方法具有可靠的準確度和精密度。

3 結(jié)論

建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測運動飲料中VB（1硫胺素）、VB（2核黃素）、VB（5泛酸）、VB（6吡哆醇）、VB（7生物素）、VB（9葉酸）、VB1（2氰鈷胺）、煙酸、煙酰胺、VC10種水溶性維生素分析的方法。結(jié)果表明，通過優(yōu)化后的質(zhì)譜條件，在MRM掃描模式下，10種水溶性維生素組分能在10min實現(xiàn)快速分離檢測。樣品經(jīng)過10％乙醇提取后，可有效去除運動飲料中的復雜基質(zhì)，可實現(xiàn)對目標物質(zhì)的凈化，能準確快速有效地檢測運動飲料中VB（1硫胺素）、VB（2核黃素）、VB（5泛酸）、VB6（吡哆醇）、VB（7生物素）、VB（9葉酸）、VB1（2氰鈷胺）、煙酸、煙酰胺、VC 10種水溶性維生素。本方法具有快速、簡單、準確、靈敏等特點，可對較寬濃度范圍內(nèi)的多種維生素進行同步分析，有助于提高食品檢測實驗室的分析效率，降低成本，為運動飲料中水溶性維生素的測定提供營養(yǎng)價值參考。

[1]蔣俊樹,趙彬.高效液相色譜法測定能量飲料中多種水溶性維生素[J].食品科學,2008,29(12)：635-637

[2]王榮艷,賈麗,錢春燕.HPLC-PDA法同時測定功能性飲料中9種水溶性維生素[J].現(xiàn)代科學儀器,2010,8(4)：98-101

[3]蒲明清,戴舒春,張連龍,等.超高效液相色譜法測定保健食品中的多種水溶性維生素[J].現(xiàn)代食品科技,2012,28(7)：886-889

[4] ASLAM J,KHAN S H,KHAN S A.Quantification of water soluble vitamins in six date palm (Phoenix dactylifera L.)cultivar’s fruits growing in Dubai,United Arab Emirates,through high performance liquid chromatography[J].Journal of Saudi Chemical Society,2013,17(1)：9-16

[5] BEITANE I,CIPROVICA I.The study of added prebiotics on B group vitamins concentration during milk fermentation[J].AC Romanian Biotechnology Letters,2011,16(6)：92-96

[6]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB/T 15266-2008運動飲料[S].北京：中國標準出版社,2008

[7]儲小軍,陶保華,賴世云,等.固相萃取-二維液相色譜法測定嬰幼兒配方食品中的維生素B12[J].浙江大學學報(農(nóng)業(yè)㈦生命科學版),2013(2)：185-190

[8]張鵬,朱姜,周元元,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定保健食品中的維生素 A、D、E[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2016,28(3)：322-326

[9]聶啟興,馮蕾,張媛媛,等.高效液相色譜法同時測定發(fā)酵前后果蔬中4種水溶性維生素[J].食品科學,2015,36(20)：101-104

[10]韓秀梅,祖述春.HPLC法測定復合維生素B片中維生素B1,B2,B6的含量[J].中國藥事,2012,26(8)：891-894

[11]陳新,張風,李健.反相離子對高效液相色譜法測定啤酒中的B族維生素[J].釀酒科技,2015(12)：119-121

[12]葉翠平,譚兆平,區(qū)碩俊.反相離子色譜法同時檢測皮炎軟膏中的6種水溶性維生素成分含量[J].當代化工,2016(8)：2050-2053

[13]CHAMPAGNE C P,TOMPKINS T A,BUCKLEY N D,et al.Effect of fermentation by pure and mixed cultures of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus helveticus on isoflavone and B-vitamin content of a fermented soy beverage[J].Food Microbiology,2010,27(7)：968-972

[14]任丹丹,謝云峰,劉佳佳,等.高效液相色譜法同時測定食品中9種水溶性維生素[J].食品科學2014,35(12)：899-903

[15]張志清,白琦,湛珺雯.RP-HPLC法測定功能性飲料水溶性維生素含量[J].食品科學,2010,31(14)：212-215

[16]周圍,王波,劉倩倩,等.超高效合相色譜法同時測定復合維生素片中11種脂溶性維生素及其衍生物[J].分析化學,2015,43(1)：115-120

[17]張榕杰,蘇⒗恒,王愛月.超高效液相色譜法同時測定維生素強化食品中多種水溶性維生素[J].中國衛(wèi)生工程學,2008,7(1)：34-36

[18]賀利民,呂岱竹,蘇貽娟.高效液相色譜法同時測定多種水溶性維生素[J].海南大學學報(自然科學版),2004,22(1)：54-60

[19]郭Ⅰ華,Ⅳ有祝.高效液相色譜法測定茶葉中五種水溶性維生素[J].食品研究㈦開發(fā),2012(8)：138-140

[20]李克,王華娟,潘朝暉,等.離子對反相高效液相色譜法同時測定復合維生素片中4種水溶性維生素[J].色譜,2013,21(1)：66-68

[21]黃力,張寶川.HPLC法測定多維片中的水溶性維生素[J].中國藥事,2007,21(4)：255-257

[22]高旭,李淑娟,安娟,等.高效液相色譜法同時測定食品中8種水溶性維生素[J].中國醫(yī)藥指南,2008,6(19)：36-38

[23]張曉娜,校瑞,牛家華,等.HPLC同時測定維生素B片中4種水溶性維生素的含量[J].河南大學學報(自然科學版),2016(9)：583-586

[24]榮琳,邵麗華,王淑娥,等.HPLC-二極管陣列檢測器同時測定保健品中7種水溶性維生素[J].衛(wèi)生研究,2009,38(5)：541-542

[25]白靖,向柏,申磊,等.HPLC法同時測定復合維生素口服液中4種水溶性維生素的含量[J].中國藥房,2011,22(29)：2747-2749

[26]李強,李揮,龐坤,等.功能性飲料中11種水溶性維生素的高通量檢測技術(shù)研究[J].河北省科學院學報,2012,29(3)：44-48

[27]宋萍萍,劉書慧.反相高效液相色譜法測定果醋中的8種維生素[J].食品科學,2012,33(12)：181-184

[28]華晶忠,劉笑笑,武巍,等.苜蓿中維生素C含量測定及變化規(guī)律[J].食品研究㈦開發(fā),2016(1)：45-47

Determination of Water-soluble Vitamins in Sports Drink by UPLC-MS/MS

ZHANG Qin
（Henan University of Animal Husbantry and Economy，Zhengzhou 450046，Henan，China）

The determination of 10 kinds of water-soluble vitamins， including vitamin B1， vitamin B2， vitamin B5， vitamin B6， vitamin B7， vitamin B9， vitamin B12， niacin， nicotinamide， vitamin C in sports drink ，was established by ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry.After the sample was treated with 10％ethanol to precipitation extraction，the separation of target compound was performed on a Waters Atalantis T3chromatographic column（2.1mm×150mm， 3μm）using 0.1％formic acid-10.0％methanol as mobile phase under gradient elution mode.The linear range of 10 kinds of water-soluble vitamins was in the range of 10.0ng/mL～1 000.0ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 3-0.999 9.The detection limit was 0.10 μg/kg-11.5 μg/kg and the quantitative limit was 0.35 μg/kg-38.0 μg/kg.The recovery rate was 90.3％-99.5％， and the relative standard deviation（RSD）was 2.0％-3.6％.

ultra high performance liquid chromatography massspectrometry（UHPLC-MS/MS）；sportsdrink；water-soluble vitamins

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.035

2017-03-23

張欽（1975—），男（漢），副教授，碩士，主要從事學校體育和社會體育。