非小細胞肺癌EGFR-TKIs耐藥
——小細胞肺癌轉化的研究進展

張文秋 李永琦 吳荻

近年來，由于分子靶向藥物對攜帶敏感突變基因的癌細胞存在精準性和敏感性，分子靶向治療已逐漸在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的治療中占據重要地位，現已成為NSCLC的一線治療方案[1,2]。其中在使用表皮生長因子受體酪氨酸酶激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）治療攜帶EGFR基因敏感突變的患者中，相比傳統的化療方案，不僅改善了患者的無進展生存期，而且提高了患者的生活質量[3-6]。但是，EGFR-TKI耐藥的產生幾乎是不可避免的，中位無進展生存期僅為11個月。2006年，Zakowski等[7]首次發現了經過EGFR-TKI治療后NSCLC轉化為小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）繼而出現耐藥的案例。2013年，NSCLC的NCCN指南明確指出EGFR-TKI的耐藥機制之一為NSCLC轉化為SCLC，大約占3%-15%的比例[8-10]。相比經典SCLC，轉化的SCLC主要發生在攜帶EGFR基因敏感突變的不吸煙的亞洲女性腺癌患者[11-13]。

1 NSCLC與SCLC細胞腫瘤干細胞的共同起源

腫瘤干細胞（cancer stem cells, CSCs）是指存在于腫瘤組織中的具有干細胞性質的一小部分細胞群體，具有自我更新、分化潛能及高致瘤性和耐藥性的特點。

目前主流觀點認為NSCLC與SCLC細胞來源于共同的腫瘤干細胞，即兩者具有“共同起源”。Tatematsu等[14]報道了攜帶EGFR敏感突變腫瘤細胞的起源細胞具有分化為神經內分泌腫瘤細胞的潛能，如分化為SCLC細胞。臨床前證據表明，在靶向干擾TP53基因和RB1基因的條件下，肺泡II型細胞也具有轉化為SCLC細胞的潛能[15]。此外，肺泡II型細胞還可作為攜帶EGFR基因突變的腺癌細胞的起源細胞[16,17]。因其同時具有轉化為NSCLC細胞和SCLC細胞的潛能，故肺泡II型細胞可視為腺癌和SCLC的腫瘤干細胞[18]。EGFR在肺泡II型細胞中具有重要作用[19,20]，分化良好的肺泡II型細胞EGFR高表達[21]。Miettinen等[20,22]認為，EGFR基因突變和活躍的EGFR信號共同驅動肺泡II型細胞的增殖和分化。當EGFR信號被EGFR-TKI抑制時，肺泡II型細胞可以發生其他關鍵基因事件，如RB1基因缺失，促進其在獨立于EGFR信號的情況下轉化為SCLC，并產生對EGFR-TKI的耐藥；然而，若肺泡II型細泡發生其他耐藥突變，如EGFR T790M突變，EGFR信號可以促使肺泡II型細胞保留腺癌組織學成分[19]。

2 NSCLC EGFR-TKIs耐藥-SCLC轉化發生機制的幾種假說

NSCLC發生EGFR-TKIs耐藥轉化為SCLC的發生機制仍不清楚。目前，針對該機制學者們共提出了兩種假說，分別為腫瘤異質性假說、NSCLC轉化為SCLC假說。

2.1 腫瘤異質性假說 腫瘤異質性是惡性腫瘤的特征之一。腫瘤異質性是由癌細胞中遺傳學和表觀遺傳學差異造成的，這些因素共同作用下，導致了帶有不同表型的疾病現象[23]。

由于腫瘤異質性，在EGFR-TKI治療前，腫瘤組織中可能同時存在NSCLC和SCLC細胞兩種成分，但病理組織學活檢只找到NSCLC成分，在EGFR-TKI對NSCLC起效的過程中，SCLC的成分逐漸顯現出來，并占據主導地位[24]。

目前針對這種假說尚有爭議。支持者認為穿刺活檢標本僅取材部分腫瘤組織，基于部分組織的病理診斷具有局限性，不能全面反映整體腫瘤組織的情況，有NSCLC和SCLC細胞兩種成分同時存在的可能性。Mangum等[25]報道，同時含有NSCLC和SCLC細胞成分的異質性腫瘤在穿刺活檢標本及手術切除標本中，分別占1%-3.2%、9%-26%的比例。由于EGFR-TKI治療后二次活檢的病理組織學和基因檢測結果絕大多數是通過穿刺活檢標本而非手術切除標本獲得，因此這些病理學綜合信息受到限制，由此可能造成抽樣誤差[26]。然而，反對者認為，這種假說是錯誤的。EGFR-TKI對攜帶EGFR敏感突變的NSCLC治療有效且療效顯著，患者無進展生存期（progression-free survival,PFS）可達1年甚至數年。SCLC的生物學行為特點為進展迅速、臨床癥狀明顯，若腫瘤早期就含有SCLC成分，在治療過程中將會出現明顯的臨床癥狀如刺激性咳嗽、呼吸困難等，并發生早期轉移[9]。

2.2 NSCLC轉化為SCLC假說 在腫瘤干細胞增殖分化的某個階段，腫瘤干細胞先向NSCLC細胞定向分化，在NSCLC細胞增殖發展的過程中，接受某些外界壓力，如EGFR-TKI，轉化為SCLC。有一些學者支持該觀點。Sequist等[7,8,10,27,28]認為，由于轉化的SCLC細胞仍然攜帶原有EGFR基因敏感突變，故可以證明SCLC并非新發[9]，而是由原有NSCLC細胞轉化而來。EGFR基因突變既可以存在于NSCLC細胞，又可以存在于SCLC細胞，進一步提示了含有EGFR基因突變的腫瘤干細胞的存在，該腫瘤干細胞可能為EGFR-TKI耐藥的起源[29,30]。

既往研究表明，EGFR-TKI并不是誘導NSCLC向SCLC轉化的唯一因素。NSCLC轉化為SCLC的發生可以獨立于針對EGFR的抑制[10]。1986年的一項統計數據顯示，5%的患者最初病理組織學診斷為NSCLC，化放療耐藥后再次行活檢，病理組織學診斷為SCLC[31]。Watanabe等[32]選取手術切除標本進行病理組織學診斷，發現6例最初診斷為腺癌的患者發生了SCLC轉化，其中僅有2例患者接受過EGFRTKI的治療，1例患者未接受任何治療。

除此之外，SCLC轉化的發生還可以獨立于EGFR基因狀態。Sequist等[8]對接受放化療后的NSCLC手術切除標本進行研究，發現EGFR野生型NSCLC比EGFR突變型NSCLC發生SCLC轉化的可能性小。

根據以上研究可以推測，EGFR-TKI及EGFR基因狀態均不是促進SCLC轉化的獨立因素，但均可以作為促進SCLC轉化的誘發因素，即攜帶EGFR敏感基因突變的NSCLC本身具有轉化為SCLC的潛質，在EGFR-TKI的暴露環境中，更易轉化為SCLC。

2.3 兩種假說之間的聯系與區別 上述兩種假說之間具有一定關聯。根據轉化時間節點不同，可將轉化的機制分為“同時性假說”和“異時性假說”，即“腫瘤異質性假說”和“NSCLC轉化為SCLC假說”。前者發生的轉化時間節點為使用EGFR-TKI治療之前，后者發生的轉化時間節點為使用EGFR-TKI治療之后（圖1）。

3 NSCLC EGFR-TKIs耐藥-SCLC轉化的分子機制

雖然越來越多的SCLC轉化作為EGFR-TKI耐藥機制的案例被報道出來，但其分子機制仍然未知。許多研究已發現一些與SCLC轉化相關甚至起到重要作用的分子事件。

3.1 RB1基因缺失 RB1基因在細胞周期G1期起調控作用，RB1基因的缺失會造成細胞周期G1期失控，在SCLC轉化中起重要作用。經典SCLC 100%存在RB1基因缺失。高頻率的RB1基因缺失發生于SCLC、前列腺癌、膀胱癌[33]。后兩者都經歷了小細胞分化[34,35]。

動物實驗證明RB1基因的缺失選擇性影響神經內分泌起源的腫瘤，導致原發神經內分泌腫瘤細胞數量的增加[36]。分子測序證實，EGFR突變耐藥轉化的SCLC細胞，100%存在RB1基因缺失。SCLC轉化前的NSCLC及SCLC轉化后仍存在的NSCLC成分均不存在這種基因改變，提示RB1基因缺失在SCLC轉化中扮演重要角色[22]。

研究發現單獨敲除RB1基因并未引起EGFR基因突變細胞向神經內分泌方向分化，證明SCLC轉化不僅僅依賴于RB1基因的缺失[22]。同時，RB1基因缺失的腺癌細胞的存在，進一步證明了僅有RB1基因的缺失對SCLC轉化是不夠的[37]。

3.2 P53基因失活 P53基因為抑癌基因，若P53基因失活，將失去其對細胞生長、凋亡和DNA修復的正常調控作用，對腫瘤形成起重要作用。

研究證明靶向干涉神經內分泌細胞的P53基因和RB1基因會導致SCLC的發生[38,39]，靶向斷裂肺泡II型細胞的P53基因和RB1基因也會導致SCLC的發生[15]，這不僅進一步證明了肺泡II型細胞可作為SCLC的起源細胞，而且證明了P53基因和RB1基因在SCLC轉化中扮演著重要角色。

3.3 PTEN M264I基因突變 PTEN基因為抑癌基因，作用為負性調控PI3K-AKT途徑，起到促進凋亡和抗增殖的作用[40]。在研究肺腺癌經吉非替尼治療后發生SCLC轉化并轉移至肝臟的案例中，發生SCLC轉化的腫瘤組織中發現PTEN M264I基因突變，仍為腺癌成分的腫瘤組織中未發現該基因突變[41]，此突變在腺癌中極少見[42-44]，據此可以推測其在SCLC轉化中具有一定作用。

3.4 PIK3CA基因突變 PI3K/AKT信號通路是重要的抗凋亡通路，而且與新生血管的生成有關。EGFR與其配體結合后，引起自身磷酸化和二聚體化，激活PI3K/AKT下游信號通路，并產生一系列磷酸化效應，這些效應蛋白共同促進腫瘤細胞的生長和蛋白質合成。

Sequist曾報道SCLC轉化伴有PIK3CA基因突變的案例，提示PIK3-AKT通路的激活可能參與SCLC的轉化。然而，PIK3CA基因的激活突變還出現在大約5%的NSCLC患者中[45]。所以，對SCLC轉化的發生而言，僅有該通路的激活是不夠的。

4 轉化的SCLC和經典SCLC之間的相似性

轉化的SCLC與經典SCLC在基因、形態學、臨床表現、藥物敏感性等方面具有相似性[22]。

基因上，RNA和微小RNAs表達的等級聚類分析表明，轉化的SCLC與經典SCLC相似，免疫組織化學染色顯示神經內分泌標記物如突觸小泡蛋白、嗜鉻粒蛋白、神經元粘附分子陽性表達[8,10,24,34,46,47]；形態學上，兩者均表現為小細胞；臨床表現上，SCLC進展迅速、易早期轉移，轉化后的SCLC增殖率快速增加、臨床表現快速惡化，轉移較早；藥物敏感性上，兩者均對標準SCLC化療方案敏感[22]。

雖然上述幾個方面體現了轉化SCLC與經典SCLC之間的相似性，然而，已發現一組經典表達在NSCLC中的微小RNA及一組經典存在于NSCLC的甲基化DNA可表達及存在于一些轉化的SCLC。因此轉化的SCLC并不能被歸為經典SCLC，也許可被歸為一種新的SCLC亞型[22]。

5 NSCLC EGFR-TKIs耐藥-SCLC轉化的治療對策

轉化SCLC與經典SCLC具有以上多方面的相似性，可以給予“耐藥機制為基礎”的治療。使用標準SCLC化療方案“順鉑/卡鉑+依托泊苷”治療轉化SCLC，療效大多顯著[8]，但有效治療過后，由于轉化SCLC具有較強侵襲性以及患者體力狀況（performance status, PS）評分等因素，大多數患者的病情在初期得到緩解后迅速進展直至患者死亡。研究數據表明，相比經典SCLC，轉化SCLC的預后相對較差。而且，SCLC轉化在EGFR-TKI難治的轉移性腫瘤中占重要部分[41]。

除此之外，由于攜帶EGFR敏感突變的SCLC對EGFRTKI治療有效，因此可推測NSCLC轉化的SCLC可能對EGFR-TKI同樣有效[9,48]，但較NSCLC療效差。Sequist等[8]報道稱，轉化為SCLC的患者在接受EGFR-TKI與化療治療的過程中，腫瘤對EGRR-TKI可以經歷“耐藥-重新敏感-耐藥”的改變，同時伴隨基因和表型改變（圖2）。該案例表明，沒有持續的EGFR-TKI選擇性壓力，耐藥機制所涉及的基因和表型改變會發生丟失，這些腫瘤對第二輪EGFRTKI治療敏感有效。在不同藥物治療的選擇性壓力之下，會出現不同克隆的選擇性[22]。同時，該案例還提示了腫瘤對EGFR-TKI耐藥具有潛在的可逆轉性，進一步強調了一次活檢不足以指導后續治療，再次活檢甚至三次活檢具有重要指導意義[8]。

Shoemaker等[49]稱，在臨床前研究中，navitoclax（ABT-263），一種BCL-2、BCL-XL抑制劑，在治療經典SCLC中顯示出顯著的療效。盡管近期臨床試驗結果證明單藥ABT-263僅在少部分患者中取得療效[50]，但聯合用藥方案仍在探索中[51]。Niederst Sequist等[22]試驗報道稱，攜帶EGFR基因敏感突變NSCLC轉化的SCLC細胞系不僅對ABT-263高度敏感，促使其產生強效凋亡作用，而且敏感度明顯強于T790M基因突變耐藥的NSCLC細胞系。這些結果表明含有ABT-263的聯合方案在轉化SCLC的治療中非常具有潛力。

Kenichi[41]稱，在EGFR-TKI耐藥過程中，腫瘤可能同時含有多個EGFR-TKI難治性耐藥機制，如T790M二次突變和SCLC轉化共同存在于同一個患者。因此，在EGFRTKI耐藥的后續治療中，考慮到一個患者體內可能有不同耐藥機制以及腫瘤存在內在異質性是重要的。

6 研究的局限性及遺留問題

圖 1 “共同起源”與兩種假說之間的聯系與區別。A：共同起源；B：腫瘤異質性假說；C：NSCLC轉化為SCLC假說。腫瘤干細胞（CSC1）在增殖分化的過程中，分化為具有特定分化能力的腫瘤定向干細胞（CSC2），該腫瘤定向干細胞既可能同時分化為NSCLC細胞和SCLC細胞，形成異質性腫瘤，EGFR-TKI可減少或消滅NSCLC細胞，而SCLC細胞殘留并逐漸占主導作用，即“腫瘤異質性假說”，也可能先分化為NSCLC細胞，該NSCLC細胞在EGFRTKI的壓力下轉化為SCLC細胞，即“NSCLC轉化為SCLC假說”。Fig 1 The association and difference between the origin of cancer stem cell and two hypothesis. A: The origin of cancer stem cell; B: The hypothesis of the tumor heterogeneity; C: The hypothesis of the transformation from non-small cell lung cancer (NSCLC) to small cell lung cancer (SCLC). During the process of proliferation and differentiation, an original cancer stem cell (CSC1) differentiate into an cancer stem cell (CSC2) with the ability of specific differentiation. This cancer stem cell (CSC2) can not only differentiate into NSCLC and SCLC cell and form the tumor heterogeneity at the same time, and EGFR-TKI can reduce or eliminate NSCLC cells, and SCLC cells residue and gradually play a leading role, which is the hypothesis of the tumor heterogeneity, but also differentiate into NSCLC cell firstly, then transform into SCLC under the pressure of EGFR-TKI, which is the hypothesis of the transformation from NSCLC into SCLC.

圖 2 腫瘤對EGFR-TKI敏感或耐藥及其基因和表型變化。攜帶EGFR L858R敏感突變的NSCLC經歷EGFR-TKI治療后轉化為SCLC，轉化SCLC保留原有EGFR L858R 突變，同時攜帶新發PIC3CA突變，經過7個月的化療，再次活檢，發現SCLC重新轉化為NSCLC，該NSCLC只攜帶原有EGFR L858R敏感突變，新發PIC3CA突變消失，此時繼續給予EGFR-TKI，再次因SCLC轉化的發生產生耐藥，此SCLC同樣保留原有EGFR L858R基因突變，同時含有新發PIC3CA突變。Fig 2 The change of the sensitivity or resistance and gene and phenotype of tumor after the treatment of EGFR-TKI. NSCLC which had sensitive EGFR L858R mutation transformed into SCLC after the treatment of EGFR-TKI, and the transformed SCLC not only retained the original EGFR L858R mutation, but also contained new PIC3CA mutation. After 7 months of chemotherapy, the second biopsy revealed NSCLC, which only contained sensitive EGFR L858R mutation, and no new PIC3CA mutation was found. At this time, EGFR-TKI was given again, then the resistance occured again because of SCLC transformation, which not only retained the original EGFR L858R mutation, but also contained new PIC3CA mutation.

目前，盡管對于SCLC轉化作為EGFR-TKI耐藥機制之一的研究已取得較大進展，但是仍有一些需要進一步研究和探討的問題。

由于SCLC轉化的發生，對SCLC進行重新分型是必要的。轉化SCLC也許可以被歸為SCLC的一個亞型，即源于腫瘤干細胞分化或NSCLC轉化并且含有EGFR基因敏感突變的一類SCLC，其無標準治療方案，預后差，總生存期短。

值得注意的是，發生SCLC轉化的大部分患者為不吸煙女性，這提示性別因素比如激素水平或者激素受體水平的不同是否在揭示SCLC轉化的過程中起到線索作用[41]?

盡管EGFR基因敏感突變持續存在，但轉化為SCLC的患者對EGFR-TKI出現耐藥，這可能是由于EGFR在蛋白水平的表達缺失[8]。未來也許可以根據檢測EGFR蛋白表達水平決定是否繼續使用EGFR-TKI[52]。Chang等[53]還提出SCLC轉化可能僅為耐藥的伴隨現象，而非主要原因的猜想。

7 小結

本文綜述了SCLC轉化作為NSCLC對EGFR-TKI的耐藥機制之一的研究進展及耐藥后治療的策略，雖然仍然有許多需要進一步研究和解決的問題，但已有的研究結果為進一步研究提供了有利的線索，耐藥機制的深入研究提供了新的治療路線，不僅有助于指導臨床用藥，而且將促進更有針對性的靶向藥物的研發。對以上假說進行驗證性研究，進而明確其轉化的分子機制，收集大量病例資料進行全面的前瞻性研究，包括生物學特性、對目前治療措施的應答率、預后等，是研究者們未來需要解決的問題。